一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用。所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品；所述制备方法包括：以与待测cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以dNTP为原料，利用引物对1进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到未甲基化对照品；以5

【技术实现步骤摘要】
一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于DNA甲基化检测
，涉及一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，参与了生物体生长发育、细胞功能调控以及疾病发生发展和转归等过程。DNA异常甲基化导致其功能异常，与多种疾病尤其是癌症的发生和发展密切相关。深入研究DNA甲基化有助于揭示生命活动过程和人类疾病发生的分子机制，对恶性肿瘤等疾病的精准早期诊断和早期干预治疗具有重要的理论价值和临床意义。在DNA甲基化研究中，全基因组甲基化(Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS)被誉为检测DNA甲基化的“金标准”，重亚硫酸盐处理DNA是一种较为常见的检测技术，重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不受影响，重亚硫酸盐转化率影响DNA甲基化检测的准确性，未能转化的DNA会在之后检测中产生假阳性，因此，评估重亚硫酸转化DNA效率对于甲基化检测非常必要。
[0003]目前，为了评估重亚硫酸盐对胞嘧啶的转化效率，一般会在重亚硫酸盐转化处理中加入1％内参对照品：常见的是甲基化酶缺陷型的大肠杆菌所生产的完全未甲基化的λDNA或从甲基化阴性的细菌中分离出来的pUC19来统计转化效率，同样也可以通过用甲基化酶处理过的CpG岛完全被甲基化的DNA或pUC19来追踪5
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甲基胞嘧啶(5
‑r/>methylcytosine，5mC)对重亚硫酸盐转化的抵抗效果。这种使用完整的λDNA基因组或pUC19内参对照品在重盐硫酸盐处理人血浆游离核酸(cfDNA)建库过程中，还需提前将其打断成与cfDNA片段大小接近，这样实验成本较高，且后续生信数据分析较为繁琐。此外，也有通过梯度稀释重亚硫酸盐处理和未处理的DNA标准品，使用qPCR建立转化与未转化的DNACt值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线，进而定量检测重亚硫酸盐处理后的DNA样本来评估转化效率，若在DNA甲基化NGS建库过程中使用该方法，需要预留重亚硫酸盐转化后的样本，会造成珍贵的cfDNA样本损失。而且额外进行qPCR检测，会增加试剂成本和时间成本。
[0004]综上所述，提供一种低成本、易于制备且能够快速评估重亚硫酸盐对人血浆cfDNA样本胞嘧啶的转化效率和检出率的内参对照品，对于cfDNA甲基化NGS检测领域具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品及其制备方法和应用，本专利技术能够快速制备价格便宜的未甲基化和甲基化内参对照品，所制备内参对照品易于稳定保存，能够快速、方便和准确地检测cfDNA样本经过重盐硫酸盐转化后的胞嘧啶转化效率和5
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甲基胞嘧啶检出率。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品；所述制备方法包括：以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以dNTP为原料，利用引物对1进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到未甲基化对照品；以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以5
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甲基
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dCTP、dATP、dGTP和dTTP为原料，利用引物对2进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到甲基化对照品。
[0008]本专利技术通过设计和合成与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA序列的引物，以与待测cfDNA样本无同源性的DNA为模板，分别以dNTP和5
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甲基化
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dCTP、dATP、dGTP和dTTP为原料，所扩增的DNA产物经纯化获得与待测cfDNA片段大小接近的未甲基化内参对照品和甲基化内参对照品，能用于同时评估重亚硫酸盐处理cfDNA样品的胞嘧啶的转化率和5
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甲基胞嘧啶检出率。
[0009]优选地，所述与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA可选自大肠杆菌噬菌体或质粒，包括但不限于λDNA、质粒pUC19、pUC18和pUC57等。
[0010]本专利技术中，所述引物对1和引物对2可以各自独立地为根据待测cfDNA样本无同源性的DNA的序列设计的引物，不作特殊限制。
[0011]优选地，所述引物扩增目标片段大小应与人血浆cfDNA片段大小接近，如166bp。
[0012]优选地，本专利技术可选择λDNA为模板设计引物对1和引物对2，进一步优选地，所述引物对1的核酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列，所述引物对2的核酸序列包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。
[0013]SEQ ID NO.1：5
’‑
cggataaactattacaacccc
‑3’
。
[0014]SEQ ID NO.2：5
’‑
catattcaggccagttatctgg
‑3’
。
[0015]SEQ ID NO.3：5
’‑
ttataatctgctggccggaac
‑3’
。
[0016]SEQ ID NO.4：5
’‑
cttcaacgagatgccacgatg
‑3’
。
[0017]所述未甲基化对照品和甲基化对照品的长度分别为163bp和167bp。
[0018]本专利技术中，可将所述未甲基化对照品和甲基化对照品DNA溶液梯度稀释，然后混合配置成的未甲基化对照品和甲基化对照品的混合DNA溶液。
[0019]第二方面，本专利技术提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品，所述对照品由第一方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法制备得到。
[0020]第三方面，本专利技术提供第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在制备检测重亚硫酸盐处理cfDNA转化率和检出率的产品中的应用。
[0021]第四方面，本专利技术提供一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理cfDNA转化率和检出率的对照品。
[0022]优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液。
[0023]第五方面，本专利技术提供第二方面所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率中的应用。
[0024]第六方面，本专利技术提供一种重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法，其特征在于，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品；所述制备方法包括：以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以dNTP为原料，利用引物对1进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到未甲基化对照品；以与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA为模板，以5
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甲基
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dCTP、dATP、dGTP和dTTP为原料，利用引物对2进行PCR扩增，纯化扩增产物，得到甲基化对照品。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA选自大肠杆菌噬菌体或质粒，包括λDNA、质粒pUC19、质粒pUC18或质粒pUC57中任意一种。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述引物对1和引物对2各自独立地为根据与待测人血浆cfDNA样本无同源性的DNA的序列设计的引物；所述未甲基化对照品和甲基化对照品的长度分别为163bp和167bp。4.一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品，其特征在于，所述对照品包括未甲基化对照品和甲基化对照品，所述对照品由权利要求1
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3任一项所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品的制备方法制备得到。5.权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在制备检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的产品中的应用。6.一种检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品；所述试剂盒还包括PCR反应液。7.权利要求4所述的检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的对照品在检测重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率中的应用。8.一种重亚硫酸盐处理人血浆cfDNA转化率和检出率的检测方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓东，汤郡，陈征，张亚飞，
申请(专利权)人：迈杰转化医学研究苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：