一种用于提高扩增子文库均一性的文库构建方法技术

本公开内容涉及一种用于提高扩增子文库均一性的文库构建方法，所述方法包括以下步骤：1)提供DNA；2)使用DNA修复酶对所述DNA进行修复以形成修复后的DNA；和3)对所述修复后的DNA进行扩增以形成扩增子文库。DNA进行扩增以形成扩增子文库。DNA进行扩增以形成扩增子文库。

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高扩增子文库均一性的文库构建方法


[0001]本专利技术属于高通量基因测序领域，具体而言，本专利技术涉及一种用于提高扩增子文库均一性的文库构建方法。

技术介绍

[0002]随着近年来资讯通量的激增，高通量测序技术在生命科学及医学领域方面的研究和应用越来越广泛，特别是在疾病诊断及预防中发挥重要作用，其主要表现在产前筛查、肿瘤诊断、重大疾病预防、健康相关宏基因组分析等方面。虽然人类全基因组测序从测序时间和成本上已有了巨大的飞跃，但庞大的数据分析和遗传信息提取也很费时费力，相比较而言，全外显子测序，基因组合(panel)的测序将直击可能引起疾病的大部分基因序列，而扩增子测序特异性强、目标明确、数据分析简单快速和成本低等优点将更有利于在临床疾病检测上的广泛应用。
[0003]扩增子测序技术是一种靶向捕获测序技术，主要利用多重PCR技术同时对多个目标区域序列进行特异性扩增和富集，得到扩增子文库，然后采用二代测序技术对扩增子文库进行测序，从而获取目标区域的序列信息。扩增子测序技术组合(panel)设计灵活，经济快速，重复性好，特异性强等优势，已成为首选技术，广泛应用于生物基础研究和临床疾病诊断。
[0004]尽管扩增子测序技术优点众多，但是也存在一些不足，其突出特点就是扩增子文库均一性差，具体表现为扩增子测序深度高低不一，参差不齐，标准差大。文库均一性差会显著增加测序的成本，同时也会限制扩增子的通量。
[0005]大量研究结果表明，随着扩增子通量的增加，引物二聚体和非特异性片段也会明显增多，导致文库的均一性急剧下降。不同引物的扩增效率的差异是文库的均一性较差的关键因素。另外，通常使用的FFPE样本在制备和保存过程中会对基因组DNA造成一定程度的损伤，比如3
’
端封闭，切割和缺口、碱基氧化、胞嘧啶(C)脱氨基为尿嘧啶(U)等，使有效的DNA减少，造成DNA与引物不能充分结合，DNA模板不能被充分利用，文库的均一性变差，甚至影响点突变(Indel)和单核苷酸变异(Single Nucleotide Variant，SNV)检测的灵敏度。
[0006]目前提高扩增子均一性的方法主要通过调整不同扩增子引物的浓度，缩小不同引物的扩增效率差异从而提高文库均一性，该方法能一定程度上改善文库的均一性，并不能完全解决；另外还可以通过控制扩增子的数量来提升文库均一性，这种方法会一定程度上限制该技术在临床诊断中的应用。综上所述，提高文库的均一性已经成为扩增子测序
亟待解决的问题，也是进一步降低扩增子测序费用、提高扩增子通量必须迈过的难关。
[0007]因此，本领域急需解决上述问题的方法，以提高文库的均一性。

技术实现思路

[0008]当前扩增子测序技术在使用DNA样本时，都是用抽提得到的DNA样本直接用于扩增子建库测序，DNA的多级空间结构及分子交联和DNA样本制备及保存过程造成的损伤会影响
DNA与引物的充分结合，DNA模板与引物不能充分结合，引物与模板结合出现偏好性，会使引物的扩增效率差异扩大，从而导致扩增子文库的均一性变差。
[0009]本申请人专利技术人首创性地利用对来源于生物样品的DNA，例如抽提后的DNA进行酶修复，显著提高文库均一性。本申请专利技术人意想不到地发现，DNA样本经DNA修复酶修复后再进行扩增子建库可以显著提高扩增子文库的均一性。例如，本申请专利技术人意想不到地发现，FFPE DNA样本经DNA修复酶修复后再进行扩增子建库可以显著提高扩增子文库的均一性。
[0010]在此基础上，本专利技术提供了：一种用于提高扩增子文库均一性的文库构建方法，所述方法包括在扩增子建库之前使用DNA修复酶对DNA样本进行修复；一种DNA修复酶和扩增试剂在制备用于前述方法的试剂盒中的用途；以及一种用于提高扩增子文库均一性的试剂盒，所述试剂盒包含：DNA修复酶，用于在扩增前对DNA进行修复；和扩增试剂，用于对修复后的DNA进行扩增。
[0011]相比于现有技术，本专利技术至少有如下优点：i. 提高有效DNA模板量，可使引物与DNA可以更充分的结合；ii. 提高文库均一性；iii. 可适用于各种各样的建库技术，包括但不限于rhAmpSeq；iv. 特别显著提高利用rhAmpSeq多重PCR技术构建的文库的均一性；v. 操作流程简单，成本低。
[0012]在第一方面，本公开内容提供了一种用于提高扩增子文库均一性的文库构建方法，所述方法包括以下步骤：1)提供来源于生物样品的DNA；2)使用DNA修复酶对所述DNA进行修复以形成修复后的DNA；和3)对所述修复后的DNA进行扩增以形成扩增子文库。
[0013]在一些实施方案中，所述DNA为抽提的DNA。
[0014]在一些实施方案中，所述生物样品为体液样品或组织样品。
[0015]在一些实施方案中，所述生物样品为石蜡包埋样品例如FFPE样品。
[0016]在一些实施方案中，所述扩增包括i)以所述修复后的DNA为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，ii)任选地进行纯化；iii)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增；和iv)任选地进行纯化，以获得目标扩增子文库。
[0017]在一些实施方案中，所述第一引物包含SEQ ID NO: 1
‑
94。
[0018]在一些实施方案中，所述第一轮和第二轮PCR扩增使用rhAmpSeq系统进行。
[0019]在第二方面，本公开内容提供了DNA修复酶和扩增试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于第一方面中任一个实施方案所述的方法中。
[0020]在一些实施方案中，所述扩增试剂包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO: 1
‑
94。
[0021]在第三方面，本公开内容提供了一种用于提高扩增子文库均一性的试剂盒，所述试剂盒包含：DNA修复酶，用于在扩增前对DNA进行修复；和扩增试剂，用于对修复后的DNA进行扩增。
[0022]在一些实施方案中，所述扩增试剂包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含
SEQ ID NO: 1
‑
94。
[0023]下列描述和实施例详细阐述了本专利技术的实施方案。要理解的是，本专利技术不限于本文所述的具体实施方案并因此可改动。本领域技术人员将认识的是，存在本专利技术的许多变动和修改，所述变动和修改均包含在其范围之内。
附图说明
[0024]图1显示根据实施例2a所述，对Qiagen试剂抽提的FFPE DNA进行酶修复而得到的扩增子文库的均一性显著提高。在图1中，横坐标代表样本编号，纵坐标代表文库均一性百分比，其中文库的均一性最高是1(100%)，数值越接近100%表明均一性越高。图中的方形代表经DNA修复酶修复的样本；而圆形代表未经DNA修复酶修复的样本。
[0025]图2显示根据实施例2a所述，对Promega试剂抽提的FFPE DNA进行酶修复而得到的扩增子文库的均一性显著提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提高扩增子文库均一性的文库构建方法，所述方法包括以下步骤：1)提供来源于生物样品的DNA；2)使用DNA修复酶对所述DNA进行修复以形成修复后的DNA；和3)对所述修复后的DNA进行扩增以形成扩增子文库。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA为抽提的DNA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品为体液样品或组织样品。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品为石蜡包埋样品，优选FFPE样品。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述扩增包括i)以所述修复后的DNA为模板，通过第一引物进行第一轮PCR扩增，ii)任选地进行纯化；iii)以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二引物进行第二轮PCR扩增；和iv)任选地进行纯化，以获得目标扩增子文库。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：李夏静，陈芳，谢正华，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：