酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，具体涉及酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术提供的保藏编号为CGMCC No.26221的酿酒酵母，是在底盘菌酿酒酵母SyBE_Sc14D18的基础上经过定点突变、常压室温等离子体诱变和过氧化氢诱导的适应性实验室进化后筛选获得的，又在该菌株的基础上提高香叶基焦磷酸合酶TmCrtE的表达以及恢复Ura3基因的表达获得了一株高产番茄红素的酿酒酵母工程菌。红素的酿酒酵母工程菌。

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]番茄红素(Lycopene)是一种深红色类胡萝卜素，分子式为C
40
H
56
,是由11个共轭双键和2个非共轭双键组成的线性多不饱和烯烃化合物，在自然界中主要存在于柚子、西瓜、番茄等蔬菜水果中。这种共价多烯结构使得番茄红素具有很强的抗氧化能力，其通过淬灭单线态氧和清除自由基来防止细胞受到氧化而被破坏，可以有效防治因衰老和免疫力下降引起的各种疾病，研究发现番茄红素具有抗癌、预防心血管疾病、降血脂等生理功能。因此，番茄红素作为一种天然有效的亲脂性抗氧化剂，广泛应用于食品工程领域和化妆品行业，有着广阔的应用前景。预计2025年全球番茄红素市场价值将增大到1.72亿美元，从2020年到2025年，在预测期内年增长率为4.4％。
[0003]据相关研究报道，在番茄红素生物合成路径中，编码香叶基香叶素焦磷酸(GGPP)合酶的CrtE和编码八氢番茄红素脱氢酶的CrtI是关键限速酶。生物合成前体的充足供应在微生物生产中起着重要作用，提高CrtE的表达水平有利于增加关键前体GGPP的积累，是增强番茄红素生物合成通量的有效途径。CrtI负责催化八氢番茄红素连续脱氢为番茄红素，其结构特征显著影响脱氢步骤及各脱氢产物比例。
[0004]传统番茄红素生产方法包括天然提取和化学合成，受到资源和成本的限制无法满足日益增长的市场需求。微生物发酵法具有生产周期短、不受气候条件限制、生产成本低、产物无毒副作用等优点，在大规模合成番茄红素方面显示出良好的商业前景。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是公认安全的模式微生物，其基因组已被完全测序方便遗传操作，且生长周期短易于培养，近年来已成为异源产物合成的热门宿主。
[0005]常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)诱变技术作为一种环境友好、安全性高、操作简单的高效物理诱变方法，因其具有放电均匀、活性粒子浓度高、突变多样性高等特点被广泛运用于工业和实验室菌种选育。有研究表明基于类胡萝卜素的抗氧化特性，使用过氧化氢作为选择压力，可以迫使菌株增强类胡萝卜素的积累以抵抗氧化胁迫，从而提高类胡萝卜素的生产上限。因此可进一步将ARTP诱变与过氧化氢诱导的适应性实验室进化(Adaptive Laboratory Evolution,ALE)相结合，充分发挥两者的优势用于菌种选育。
[0006]微生物代谢网络极其复杂，许多生物合成的调控机制还未完全阐明。随机突变结合适应性进化并进行高通量筛选，为进一步挖掘工程菌株的生产潜力提供了一种可行的策略。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。本专利技术提供了引入BtCrtI突变体，并进行诱变以及基因编辑的酿酒酵母工程菌，以及该
菌在生产番茄红素中的应用。
[0008]本专利技术提供了一种工程菌的构建方法，包括对底盘菌中的CrtI基因定点突变后进行诱变后获得；
[0009]其中，所述CrtI基因定点突变包括使其编码的氨基酸序列中，第355位的丙氨酸突变为缬氨酸、第160位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和/或第576位的天冬酰胺突变为丝氨酸；具体的，所述CrtI基因定点突变的位点可以是1个，例如第355位的丙氨酸突变为缬氨酸、第160位的酪氨酸突变为苯丙氨酸或第576位的天冬酰胺突变为丝氨酸；可以是2个，例如第355位的丙氨酸突变为缬氨酸和第160位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第355位的丙氨酸突变为缬氨酸和第576位的天冬酰胺突变为丝氨酸、第160位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第576位的天冬酰胺突变为丝氨酸；也可以是3个，例如第355位的丙氨酸突变为缬氨酸、第160位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和第576位的天冬酰胺突变为丝氨酸，本专利技术对此不做限定。
[0010]所述诱变包括常压室温等离子体诱变和/或过氧化氢诱导的适应性实验室进化。所述常压室温等离子体诱变随机突变产生大量突变体文库，过氧化氢诱导的适应性实验室进化能够富集大量有益突变体，两者的结合有利于提高诱变效率。
[0011]具体的，在本专利技术的实施例中，通过对菌株致死率和凋亡数量的统计，发现所述常压室温等离子体诱变的时间为35s时能够获得更有效的突变，所述过氧化氢诱导的适应性实验室进化的次数为15次时，能够获得番茄红素产量更高的突变体菌株。
[0012]进一步的，本专利技术所述工程菌的构建方法还包括增强CrtE基因的表达和/或恢复Ura3基因的表达。所述CrtE基因编码香叶基香叶素焦磷酸(GGPP)合酶，提高CrtE的表达水平有利于增加关键前体GGPP的积累，增强番茄红素生物合成通量，恢复Ura3基因的表达促进了细胞的生长，提高了番茄红素的产量。
[0013]更进一步的，本专利技术提供的所述构建方法中的底盘菌为酿酒酵母SyBE_Sc14D18，其为论文《高产番茄红素酿酒酵母的设计构建与发酵过程优化》中提到的菌株SyBE_Sc14D18。
[0014]本专利技术提供的工程菌的构建方法，在酿酒酵母SyBE_Sc14D18的基础上通过定点诱变使得菌株的番茄红素的产量和纯度得到了提升；又通过采用常压室温等离子体诱变和过氧化氢诱导的实验室进化筛选到一株高产番茄红素的菌株yZK006并在保藏机构进行了保藏。在菌株yZK006的基础上通过增强香叶基焦磷酸合酶TmCrtE的表达促进番茄红素的生物合成，恢复Ura3基因的表达促进菌株的生长，进一步提高了番茄红素的产量，并且在发酵培养中不需要添加额外的尿嘧啶，降低了发酵的成本。
[0015]本专利技术提供了保藏编号为CGMCC No.26221的酿酒酵母，该菌株于2022.12.25保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0016]本专利技术还提供了一株酿酒酵母工程菌，其包括所述保藏编号为CGMCC No.26221的酿酒酵母中CrtE基因的表达增强和/或Ura3基因的表达恢复。
[0017]所述酿酒酵母工程菌的构建方法包括将保藏编号为CGMCC No.26221的酿酒酵母中的CrtE基因增强表达和/或Ura3基因恢复表达。在一些具体的实施例中，所述增强CrtE基因的表达包括将P
GAL1
‑
TmCrtE
‑
T
GPM1
插入菌株HO位点，所述恢复Ura3的表达包括将P
Ura3
‑
Ura3
‑
T
Ura3
插入菌株DAK2
‑
ZNF1位点。
[0018]本专利技术提供了所述保藏编号为CGMCC No.26221的酿酒酵母或酿酒酵母工程菌在制备番茄红素中的应用。
[0019]本专利技术还提供了番茄红素的制备方法，包括发酵培养保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.工程菌的构建方法，其特征在于，包括对底盘菌中的CrtI基因定点突变后进行诱变后获得；所述CrtI基因定点突变包括使其编码的氨基酸序列中，第355位的丙氨酸突变为缬氨酸、第160位的酪氨酸突变为苯丙氨酸和/或第576位的天冬酰胺突变为丝氨酸。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述诱变包括常压室温等离子体诱变和/或过氧化氢诱导的适应性实验室进化。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述常压室温等离子体诱变的时间为35s；所述过氧化氢诱导的适应性实验室进化的次数为15次。4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，还包括增强CrtE基因的表达和/或恢复Ura3基因的表达。5.根据权利要求1～4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述底盘菌为酿酒酵母SyBE_Sc14D18。6.保藏编号为CGMCC No.26221的酿酒酵母。7.酿酒酵母工程菌，其特征在于，为权利要求6所述保藏编号为CGMCCNo.26221的酿酒酵母中CrtE基因的表达增强和/或Ura3基因的表达恢复。8.权利要求7所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括增强权利要求6所述保藏编号为C...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，周魁，姚明东，肖文海，王颖，梁楠，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：