本发明专利技术属于菌株活性提高领域，涉及一种采用真空紫外射频等离子体提高产黄青霉生物量及青霉素产量的方法，包括将长满产黄青霉的PDA平板置于冷等离子体处理设备中，以氦气(He)为冷等离子体气源，通过射频放电，产生氦高能等离子体和真空紫外光子。这些高能粒子和真空紫外光作用于产黄青霉，激发后者产生积极的生物学效应，以提升菌体对青霉素的合成能力。该方法的整个处理过程在常温下进行，可在处理后直接进行接种发酵，时间短，成本低且绿色环保，因此具有广阔的应用前景。因此具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
采用真空紫外射频等离子体提高产黄青霉生物量及青霉素产量的方法
[0001]本专利技术涉及一种采用真空紫外射频等离子体提高产黄青霉生物量及青霉素产量的方法，属于菌株活性提高领域。
技术介绍
[0002]产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科青霉属真菌，也是一种无性型真菌。分布于土壤、空气及腐败的有机材料等基物。外形呈辐射状皱纹，边缘丝状体呈白色，分生孢子呈蓝绿色，并有些许浅黄色渗出液及可溶性色素。产黄青霉可产生青霉素、多种酶类及有机酸，也是工业上典型的青霉素生产菌。
[0003]目前，人们对冷等离子体技术的应用主要集中在常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)。这种技术操作简易，条件温和，安全便捷，并容易实现连续化工作。然而，这种技术也存在一些问题，如无法在材料表面发生因光子碰撞引起的光化学反应。另外，该技术采用的是菌种诱变原理，存在对菌株的致死率较高，突变率低等问题，诱变后需要进行繁琐的筛菌过程，工作量大，实验周期长，会限制相关技术的发展。
技术实现思路
[0004]为了更高效的提高产黄青霉生物量及青霉素产量，本专利技术基于真空紫外射频等离子体处理提高产黄青霉生物量及青霉素产量，利用高能粒子轰击和真空紫外光照射的双重作用，激发后者产生积极的生物学效应，以提升菌体对青霉素的合成能力。真空紫外射频等离子体作用于产黄青霉是等离子体的一种新应用，真空紫外射频等离子体的产生方法为：首先使用真空泵对工作腔体抽真空至本底(2Pa)；然后给定工作气体至设定气压；最后打开等离子体电源(13.56MHz)，使其辉光放电，最终产生高能量真空紫外等离子体。冷等离子体处理就是通过射频放电产生的高能粒子和真空紫外光子均匀作用在长有菌株的平板表面，使菌体代谢能力得到提升，从而达到预处理的效果。此种方法处理时间短、成本低廉和绿色环保，因此具有广阔的应用前景。
[0005]为了实现本专利技术目的，所采用的技术方案为：一种采用真空紫外射频等离子体提高产黄青霉生物量及青霉素产量的方法，包括如下步骤：将长满产黄青霉的PDA平板至于冷等离子体处理设备中，以氦气(He)为等离子体气源，在一定放电功率和工作气压下，经射频放电产生氦高能等离子体和真空紫外光。在此等离子体气氛中处理菌体一段时间。
[0006]进一步的，所述冷等离子体处理设备处理产黄青霉的放电功率为130
‑
150W(更进一步优选140W)。
[0007]进一步的，所述冷等离子体处理设备处理产黄青霉的放电时间为25
‑
35s(更进一步优选30s)。
[0008]进一步的，所述冷等离子体处理设备处理产黄青霉的工作气压为80
‑
100Pa(更进一步优选90Pa)。
[0009]在较短时间内均匀照射产黄青霉。菌体受高能粒子轰击和真空紫外光照射的双重作用，激发了一些积极的生物学效应，如生长加快、代谢水平提高、酶活性增强等，最终引起菌体中青霉素合成能力的提升。
[0010]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0011]1.本专利技术采用冷等离子体中的真空紫外光辐射产黄青霉，整个过程在常温下进行，处理时间短；通过高能粒子轰击和真空紫外光照射的双重作用改变菌体中活性组分的能级状态以提高其代谢能力，而非传统的诱变技术；可在处理结束后直接进行接种发酵，大大缩短生产周期，简化生产过程；能有效节省公司和企业的人力、物力和时间成本。
[0012]2.改变了传统的提高产黄青霉生物量及青霉素产量的方法，摈弃了繁琐的筛菌和改造过程，成本更加低廉且绿色环保。
具体实施方式
[0013]本专利技术下面结合实施例作进一步详述：
[0014]以下实施例采用真空紫外射频等离子体提高产黄青霉生物量及青霉素产量的方法，包括如下步骤：将长满产黄青霉的PDA平板至于冷等离子体处理设备中，以氦气(He)为等离子体气源，在一定放电功率和工作气压下，经射频放电产生等离子体，并在此气氛中处理菌体一段时间。各实施例的放电功率、处理时间及工作气压取值见表1。
[0015]以下实施例中生长速率测定方法，包括如下步骤：
[0016](1)PDA液体培养基(g/L)：马铃薯浸粉5.0，葡萄糖20.0，氯霉素0.1，pH5.8
‑
6.2，搅拌混匀，高温(121℃)灭菌20min。固体培养基加15.0g/L琼脂。
[0017](2)用接种环从真空紫外射频等离子体处理过的产黄青霉中挑取单菌落至30mL步骤(1)中的PDA液体培养基中。活化2d后，按10％的接种量接种至100mL步骤(2)的发酵培养基中，30℃，200r/min条件发酵培养5h。每1d取1瓶,采用减压抽滤的方法将上清液与菌丝分离，用蒸馏水清洗菌丝三次直至菌丝变得澄清，放入60℃的烘箱中烘干，最后用分析天平进行称重。以未经处理的产黄青霉作为对照。
[0018](3)吸取6mL的上清液，采用萃取及反萃取的方法提取青霉素，最后采用高效液相色谱(HPLC)进行青霉素含量测定。每组3个平行样，以未经处理的产黄青霉作为对照。
[0019]以下实施例采用萃取法提取青霉素
[0020]1.原理
[0021]青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下将青霉素转入有机溶媒中，调节PH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。
[0022]2.操作方法如下
[0023](1)配制10mM磷酸盐缓冲溶液：称取磷酸二氢钾0.34g，加入250mL蒸馏水搅拌溶解，加入磷酸氢二钾调节pH至7.5。
[0024](2)取上清液6mL，加入盐酸溶液，调节pH至2左右。
[0025](3)加入乙酸丁酯溶液，每次2mL，重复三次，留上层溶液。
[0026](4)加入磷酸盐缓冲液，每次2mL，重复三次，留上层溶液(以上步骤均在4℃下进行)。
[0027](5)冷冻2h后，放入冻干机中进行冻干。
[0028]以下实施例采用高效液相法(HPLC)测定青霉素
[0029](1)仪器：安捷伦1100，4.6
×
250mm RPC18
[0030](2)色谱条件：进样量20μL，流速1mL/min，检测波长214nm
[0031](3)流动相：A相为30mM甲酸铵溶液pH5.0和5％乙腈。B相为30mM甲酸铵溶液pH5.0和80％乙腈，采用等度法(85％A)进行洗脱。
[0032]前期单因素预实验确定放电功率(130
‑
150W)，工作气压(80
‑
100Pa)和放电时间(25
‑
35s)。本专利技术中的实施例以单因素实验为基础，进一步采用正交实验进行优化。下面将结合表1进一步说明本专利技术，但本专利技术要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
[0033]表1正交实验条本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高产黄青霉生物量及青霉素产量的方法，其特征在于：将长满产黄青霉的PDA平板至于冷等离子体处理设备中，以氦气为等离子体气源，控制放电功率为130
‑
150W，工作气压为80
‑
100Pa，使菌株受到氦高能等离子体和真空紫外光的双重作用，放电时间为25
‑
35s。2.根据权利要求1所述的提...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱劼，王友君，易霞，陈群，郭艳，徐小燕，任建军，周政忠，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：
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