一种鱼腥藻化学诱变的方法技术

本发明专利技术提供鱼腥藻化学诱变的方法，所述方法包括使用诱变剂亚硝基胍对鱼腥藻进行诱变处理，其中亚硝基胍的诱变浓度为0.1g/L，诱变时长为1

【技术实现步骤摘要】
一种鱼腥藻化学诱变的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及鱼腥藻的化学诱变方法。

技术介绍

[0002]固氮蓝藻适合在18
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38℃生长，最适温度为28
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35℃，已知有33个属150多种具有固氮作用，其中多数属于鱼腥藻、念珠藻、简孢藻、单岐藻、项圈藻、眉藻等(沈银武等，1993)。固氮蓝藻生长在诸如铵态氮或硝态氮的氮源培养基上时，生长成以光合作用细胞为主的藻体，但在氮源缺乏时，通过增强呼吸作用，丢失光系统Ⅱ和藻胆体，在细胞壁形成气体扩散的障碍夹层，从而专门特化出一部分细胞形成含有高度厌氧固氮酶的异形胞，发挥生物固氮功能(Maldener I et al.2003)。迄今为止，共有三类基因不同，但结构和机制相似的固氮酶被报道(Bishop P.E.et al.1986；Chisnell J.R.et al.1988；Dos Santos P.C.et al.2011)。其中最具代表性的是钼依赖的固氮酶，其包含两个催化部分，二聚体的铁蛋白和四聚体的钼铁蛋白(Rubio LM.et al.2005；Jimenez
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Vicente E.et al.2018)。
[0003]第一次绿色革命是作物优良性状和化肥和农药兼施的共同成果，它在提振全球粮食供给的同时，所带来的问题也愈加凸显。如：化肥连年过度施用造成土壤生态结构恶化，加剧环境污染，农业成本逐渐增加，种质优势退化等。为了保障粮食增产的可持续性，越来越多的研究开始将目光投向共生领域，如根瘤共生、菟丝子共生、稻藻共生等。这类研究一方面降低共生生物对作物的负面影响，另一方面充分发挥它们在生物固氮、经济价值等方面的优势，成为关系国计民生的重要研究方向之一。针对化肥的减施增效，蓝藻的固碳和固氮性质赋予它们作为优良绿肥的巨大潜质，早在1939年就有研究指出固氮蓝藻可为水稻田提供氮肥(De P.，1939)，随后有跟进试验发现接种蓝藻后的稻田可增产5
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30％，我国在1978年发表的论文中显示，晚稻田养藻水稻实现增产10％(中国科学院水生生物研究所第五室藻类实验生态学组1978)。将蓝藻作为绿肥来源另一个重要意义就是实现变废为宝。当下工业废水和废料引发环境污染的事件时有发生，如对养殖业和淡水湖泊养护造成巨大损失的“水华”，“罪魁祸首”正是在富营养化水体中爆发式增殖的蓝藻。蓝藻自发利用富营养化的废水，在适合温度和光照条件下快速繁殖，体现了其在环境治理上的天然优势。对废水物料的排放，藻种播撒与收集加以科学调配，全面纳入可控范畴，即可实现废物利用和化肥减施的双赢。
[0004]我国稻区虽然分布广泛，但主要集中在长江中下游和东北的黑龙江地区。固氮蓝藻的适宜生长温度通常为25℃，过高或过低的环境温度均会降低其生长速度，极大限制了利用固氮蓝藻对土壤肥力进行改善的策略实施。对藻种进行诱变筛选以获得适宜特定环境施用的藻种是行之有效的方法之一。藻类的诱变方式主要有物理射线诱变、化学诱变和自然突变分离(黄开耀等，1998)。利用紫外或γ射线对钝顶节旋藻进行照射诱变就是通过物理方式获得了大量突变体(曹媛媛等，2006)。相对而言，化学诱变在诱变剂种类、诱变浓度、处理时长、诱变设施等方面均具有调节方式灵活，便于开展的独特优势。如殷春涛等利用亚硝基胍(NTG)诱变获得螺旋藻新品种(殷春涛等，1997)，关剑使用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变
选育获得耐低温的节旋藻(关剑，2017)。但针对普遍具有固氮功能的鱼腥藻诱变方法却鲜有报道，成为制约该类蓝藻走向实际应用的瓶颈所在。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一方面，本专利技术提供鱼腥藻的诱变方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0007]a.诱变前处理：离心收集鱼腥藻，并使用缓冲溶液重悬藻体，重复离心及重悬以去除培养基成分，为后续孵育提供单一诱变环境；
[0008]b.诱变处理：使用诱变剂亚硝基胍对步骤a获得的藻体进行诱变处理，其中亚硝基胍的诱变浓度为0.1g/L，诱变时长为1
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2h，诱变环境条件：22℃下避光静置处理，诱变结束后离心收集藻体，22℃下避光恢复培养；
[0009]c.诱变后的藻种筛选：鱼腥藻藻体涂布于培养基上，25℃，低光照强度2000lux，光周期16h光照/8h黑暗培养，经15
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25天培养，涂布未经诱变的藻体平板出现黄化(长时间不予继代，培养后期固体平板上藻斑的藻体密度过高，因固着不能移动，藻体的生长代谢相互间存在竞争，随着培养基中的营养消耗，这种竞争逐步加剧。藻体黄化是死亡的表现，未经诱变的藻株因为基因组相同，通常会同时大片死亡)，而涂布诱变后的藻体平板则存留着单菌落(诱变使得鱼腥藻基因组发生改变，不同藻株间的生长代谢是有差异的)，从而获得诱变后的鱼腥藻。
[0010]在一些实施方案中，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
[0011]在一些实施方案中，所述缓冲溶液的pH为7.5。
[0012]在一些实施方案中，所述培养基为BG11培养基。
[0013]在一些实施方案中，所述诱变后的鱼腥藻在无氮BG11培养基上培养。
[0014]在一些实施方案中，所述亚硝基胍用丙酮配制，pH7.0的PBS缓冲溶液稀释。
[0015]在一些实施方案中，加入诱变剂亚硝基胍混匀后用锡箔纸包裹。
[0016]在一些实施方案中，分别在22℃和35℃对诱变后的鱼腥藻进行进一步筛选，以适应鱼腥藻的田间使用。
[0017]在一些实施方案，所述诱变后的鱼腥藻相比于野生型鱼腥藻生长速度增加。
[0018]另一方面，本专利技术提供通过上述方法获得的鱼腥藻。
[0019]另一方面，本专利技术提供通过上述方法获得的鱼腥藻在固氮中的用途。
[0020]另一方面，本专利技术提供固氮制剂，其特征在于所述固氮制剂包括通过上述方法获得的鱼腥藻。
[0021]另一方面，本专利技术提供改善土壤肥力的制剂，其特征在于所述改善土壤肥力的制剂包括通过上述方法获得的鱼腥藻。
[0022]另一方面，本专利技术提供鱼腥藻的诱变试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括亚硝基胍，任选地，还包括丙酮和PBS缓冲溶液稀释。
[0023]在一些实施方案中，所述试剂盒还包括BG11培养基和无氮BG11培养基。
[0024]另一专利技术，本专利技术提供诱变后的鱼腥藻，其特征在于，所述诱变后的鱼腥藻相比于野生型鱼腥藻生长速度增加。
[0025]定义
[0026]鱼腥藻属：是一类能够分化异形胞来进行固氮的蓝藻。异形胞是由营养细胞变态而形成的，里面含有固氮酶。鱼腥藻属的固氮效率与异形胞直接相关，异形胞的数量、大小以及内含固氮酶的酶活，都是决定鱼腥藻属固氮效率的直接因素。
[0027]BG11培养基(BG11 Medium for Blue Green Algae)中文名称蓝绿培养基或蓝绿水藻培养基，用于培养淡水水藻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鱼腥藻的诱变方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a.诱变前处理：离心收集鱼腥藻，并使用缓冲溶液重悬藻体，重复离心及重悬以去除培养基成分，为后续孵育提供单一诱变环境；b.诱变处理：使用诱变剂亚硝基胍对步骤a获得的藻体进行诱变处理，其中亚硝基胍的诱变浓度为0.1g/L，诱变时长为1
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2h，诱变环境条件：22℃下避光静置处理，诱变结束后离心收集藻体，22℃下避光恢复培养；c.诱变后的藻种筛选：鱼腥藻藻体涂布于培养基上，25℃，低光照强度2000lux，光周期16h光照/8h黑暗培养，经15
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25天培养，涂布未经诱变的藻体平板出现黄化，而涂布诱变后的藻体平板则存留着单菌落，从而获得诱变后的鱼腥藻。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述缓冲溶液的pH为7.5。4.根据权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠敏，张世佳，刘会丽，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：