一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，涉及碳源添加策略在发酵过程优化中的应用技术领域。本发明专利技术用重组毕赤酵母ＧＳ１１５为发酵菌株，在发酵诱导期以恒速或加速添加山梨醇到发酵液中，以提高细胞活力，减弱甲醇的毒害作用，进而提高碱性果胶酶的产量。较低的山梨醇添加量不仅不会抑制甲醇对菌体的产酶效果，还可以从一定程度上削弱菌体受到的甲醇毒害作用，从而进一步提高产酶效率。当山梨醇采用变速流加（０．９ｇ／ｈ－７．２ｇ／ｈ）时，酶活从对照的９３０Ｕ／ｍｌ提高到１５４１Ｕ／ｍｌ。本发明专利技术工艺简单有效，而且可应用于今后果胶酶的工业化生产中，且对其它的毕赤酵母发酵过程优化具有一定的指导意义。
【技术实现步骤摘要】
利用重组毕赤酵母作为宿主高效表达碱性果胶酶， 一种用添加山梨醇提高 发酵生产碱性果胶酶产量的方法，涉及碳源添加策略在发酵过程优化中的应用
技术介绍
碱性果胶酶是一类能在碱性条件下高效分解植物组织中果胶质(由D-半乳糖 醛酸以a-l， 4糖苷键连接形成的直链状的聚合物)的酶的总称，作为一种用于纺织 清洁生产的全新温和的生物精练酶制剂而备受关注。在前期研究中，本研究室 在分离筛选得到一株碱性果胶酶高产菌株WSHB04-02的基础上，将其原核碱性 果胶酯裂解酶基因尸丄利用穿梭载体pPIC9K的连接，并成功表达于毕赤酵母 GS115中，菌种保藏号为CGMCCN0.2143。之后的研究工作都围绕重组毕赤酵 母发酵过程优化而展开。在发酵过程的诱导阶段，由于长时间的流加甲醇，对 细胞活力有着较强的毒害作用，因此如何在高效的诱导表达阶段又可以维持细 胞的活力是进一步提高酶活的关键问题。利用山梨醇的低速流加便可以解决这 一问题，提高果胶酶的产量，尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用添加山梨醇的策略提高发酵生产碱性果胶酶产 量的方法，利用本专利技术能显著提高碱性果胶酶的产量。本专利技术的技术方案 一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，用重组毕赤酵母GS115为发酵菌株，在发酵诱导期以恒速或加速添加山梨醇到发酵液中，以提高细胞活力，减弱甲醇的毒害作用，进而提高碱性果胶酶的产量；流加速度从0.9g/h至7.2g/h的固体山梨醇计范围内任选一恒定速度，配成 体积百分浓度50%山梨醇溶液进行流加；或流加速度以每10h提高流速0.6g/h，从0.9g/h逐步提高至7.2g/h，配成 体积百分浓度50%山梨醇溶液进行流加。碱性果胶酶的产量随山梨醇流速的提高而提高，但是当其流速过高时，碱 性果胶酶的产量又会减少。在山梨醇的恒定添加速度为3.6g/h时，碱性果胶酶 的产量由对照(不添加山梨醇)的930U/mL提高到1389U/mL。当采用梯度增加山 梨醇的添加流速时，发现碱性果胶酶的产量提高到1541U/mL。碱性果胶酶酶活的测定取一定量发酵液于10000 r/min离心10 min，上清液作为碱性果胶酶活性测定的样品。反应体系中包括粗酶稀释液(一般稀释200-800倍不等)20 pL， 2 mL含0.2y。聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH缓冲液(缓 冲液配方甘氨酸1.8775g， NaOH0.35g， CaCl2-2H20 0.028g定容至500mL)， 以无活性的酶液作为空白对照，以含底物的缓冲溶液的加入起动酶促反应；反 应条件为45 。C反应15 min，用3 mL 0.03 mol/L的磷酸终止反应，在235 nm处 测定其吸光度值。一个标准酶活单位(l U)定义为每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1 pmol的 不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。本专利技术的有益效果利用本专利技术能显著提高碱性果胶酶的产量。较低的山 梨醇添加量不仅不会抑制甲醇对菌体的产酶效果，还可以从一定程度上削弱菌 体受到的甲醇毒害作用，从而进一步提高产酶效率。此外，本专利技术所提供的通 过添加山梨醇提高产外源蛋白的策略对其它的毕赤酵母的表达体系也有一定的 借鉴和指导作用。 具体实施例方式对照实施例本专利技术所用的菌种重组毕赤酵母P户O^W^GS115为宿主，整合来自Ba"7/M sp. WSHB04-02菌株中的碱性果胶酶的编码基因，具有His+ 和Mut+表型，拷贝数为2-3个。重组毕赤酵母P ; wtor^ GS115已在生物工程 学报2008.24 (4) .p635陽639公开。土昔养基种子培养基葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。 分批发酵培养基为85。/。磷酸26.7mL/L， CaSO40.93 g/L， K2S04 18.2 g/L，MgS04.7H20 14.9 g/L， KOH4,13g/L，甘油40.0 g/L， PTM1 4.35 mL/L， 25%氨水调pH5.5。补料生长培养基50 %(『/^)甘油(含12 mL/L PTM1)。 发酵诱导培养基100%甲醇(含12mL/LPTMl)。培养条件先从保藏菌种的甘油管转至摇瓶在3(TC， 200rpm的摇床中培养 24小时，然后在3L发酵罐中进行发酵，第一阶段为生长期36h左右，第二阶段 为诱导期100h左右，发酵条件为pH5.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧30% 以上，通气速率2.0 wm，生长期温度维持在30。C,诱导期温度降为22。C。基于此工艺下的发酵法生产碱性果胶酶，产量可达930U/mL左右。实施例l:发酵罐发酵采用山梨醇恒速添加策略，其余条件同对照实施例。 发酵进入诱导期时添加山梨醇(50%， v/v， 1.8g/h的固体山梨醇)。结果碱性果 胶酶的产量由对照的930U/mL提高到1176U/mL。实施例2:发酵罐发酵采用山梨醇恒速添加策略，其余条件同对照实施例。 发酵进入诱导期时添加山梨醇(50y。，v/v， 3.6g/h的固体山梨醇)。结果碱性果胶酶的产量由对照的930U/mL提高到1389U/mL。实施例3:发酵罐发酵采用山梨醇恒速添加策略，其余条件同对照实施例。 发酵进入诱导期时添加山梨醇(50%, v/v， 5.4g/h的固体山梨醇)。结果碱性果 胶酶的产量由对照的930U/mL提高到1211U/mL。实施例4:发酵罐发酵采用山梨醇变速添加策略，其余条件同对照实施例。 发酵进入诱导期时添加山梨醇(50Q/。，v/v，流加速度从0.9g/h逐步提高至7.2g/h， 每10h提高流速0.6g/h)。结果碱性果胶酶的产量由对照的930U/mL提高到 1541U/mL0权利要求1、，其特征是用重组毕赤酵母GS115为发酵菌株，在发酵诱导期以恒速或加速添加山梨醇到发酵液中，以提高细胞活力，减弱甲醇的毒害作用，进而提高碱性果胶酶的产量；流加速度从0.9g/h至7.2g/h的固体山梨醇计范围内任选一恒定速度，配成体积百分浓度50％山梨醇溶液进行流加；或流加速度以每10h提高流速0.6g/h，从0.9g/h逐步提高至7.2g/h，配成体积百分浓度50％山梨醇溶液进行流加。全文摘要，涉及碳源添加策略在发酵过程优化中的应用
本专利技术用重组毕赤酵母GS115为发酵菌株，在发酵诱导期以恒速或加速添加山梨醇到发酵液中，以提高细胞活力，减弱甲醇的毒害作用，进而提高碱性果胶酶的产量。较低的山梨醇添加量不仅不会抑制甲醇对菌体的产酶效果，还可以从一定程度上削弱菌体受到的甲醇毒害作用，从而进一步提高产酶效率。当山梨醇采用变速流加(0.9g/h-7.2g/h)时，酶活从对照的930U/ml提高到1541U/ml。本专利技术工艺简单有效，而且可应用于今后果胶酶的工业化生产中，且对其它的毕赤酵母发酵过程优化具有一定的指导意义。文档编号C12N9/26GK101525604SQ20091003083公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日专利技术者堵国成, 张东旭, 李江华, 汪志浩, 坚 陈 申请人:江南大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用添加山梨醇提高发酵生产碱性果胶酶产量的方法，其特征是用重组毕赤酵母ＧＳ１１５为发酵菌株，在发酵诱导期以恒速或加速添加山梨醇到发酵液中，以提高细胞活力，减弱甲醇的毒害作用，进而提高碱性果胶酶的产量； 流加速度从０．９ｇ／ｈ至７．２ ｇ／ｈ的固体山梨醇计范围内任选一恒定速度，配成体积百分浓度５０％山梨醇溶液进行流加； 或流加速度以每１０ｈ提高流速０．６ｇ／ｈ，从０．９ｇ／ｈ逐步提高至７．２ｇ／ｈ，配成体积百分浓度５０％山梨醇溶液进行流加。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，汪志浩，李江华，堵国成，张东旭，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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