一种哺乳动物通用的RNA内参基因及其引物和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种哺乳动物通用的RNA内参基因及其引物和应用；所述内参基因为PPIP5K2基因；上游引物为CATTGGCTTTCACATCCAGT，下游引物为ACCTTTTAACAGCAGAACCG；探针为CTTGTGGAACAGAAGCAGAATCCTACTG。本发明专利技术首次提出在哺乳动物RNA病毒PCR检测中建立通用的内参基因；首次提出将动物的PPIP5K2基因作为内参基因用于哺乳动物RNA病毒的RT

【技术实现步骤摘要】
一种哺乳动物通用的RNA内参基因及其引物和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种哺乳动物通用的RNA内参基因及其引物和应用，尤其涉及一种可应用于动物病原体RNA PCR检测的哺乳动物通用内参基因及引物探针，对多种哺乳动物、多种组织通用，不受基因组DNA的干扰。

技术介绍

[0002]动物病毒的感染不仅对农业生产造成重大影响，许多人畜共患病毒也危害到人类的健康。为了防治病毒性疾病，PCR技术广泛地应用在了动物疫病检测领域，而为了提高PCR的检测质量，有必要引入内参基因检测。
[0003]由于RNA稳定性远低于DNA，而相关诊断实验涉及流程多，包括临床样本采集、样本保存运输、RNA提取、RT
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qPCR反应，其中任何一步操作失误导致RNA被降解或者抑制物过多使得扩增反应失败，都可导致实验假阴性。若进行内源性内参基因的检测，在RT
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qPCR诊断病原的同时检测样本中内源基因的mRNA，可有效对临床样本采集、样本保存运输、RNA提取、RT
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qPCR反应等全实验过程进行质控，排除实验操作失误、试剂故障、反应失败，一定程度上可规避假阴性，提升诊断结果的可靠度。
[0004]不少RNA病毒都能以多种哺乳动物充当宿主，例如戊型肝炎病毒、流感病毒、口蹄疫病毒、汉坦病毒等。因此进行动物RNA病毒PCR监测时可能需要从多种动物样本进行检测，能适用于多种哺乳动物的内参引物具有较强的实用价值。
[0005]对DNA病毒进行PCR检测时设计哺乳动物通用内参引物是易于实现的，例如公认的18s RNA的基因在多个物种内高度保守，可以选择合适的区域设计多种动物的通用DNA内参基因引物，但这些基因不适合用于RNA的内参，因为其基因不含大片段内含子因而无法避开基因组DNA的干扰。
[0006]通常的RNA内参技术往往仅适用于人或某一种动物，例如专利《一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法》(CN 113789411B)中使用β
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actin作为内参基因，对人类基因可以扩增，对其他哺乳动物则不一定适用。
[0007]此外国内常采用的内参质控方式是，在样品运输到实验室后，在核酸提取之前或在RT
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qPCR之前加入外源基因或含外源基因的假病毒，该方法并不能有效监控到上游样本采集和运输保藏过程，且增加额外的实验操作步骤和物料成本。本专利技术采用内源内参基因检测，避免了这一缺点。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种哺乳动物通用的RNA内参基因及其引物和应用。该应用于哺乳动物病原体RNA PCR检测的通用内参基因，即PPIP5K2基因，以及检测PPIP5K2基因的人工合成的引物探针序列，其上游引物为CATTGGCTTTCACATCCAGT，下游引物为ACCTTTTAACAGCAGAACCG，探针为CTTGTGGAACAGAAGCAGAATCCTACTG。该引物探针可以作为多种动物病原体RNA PCR检测试剂
盒的组分，用于哺乳动物内参基因的检测。
[0009]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0010]第一方面，本专利技术涉及一种用于动物病原体RNA 核酸扩增检测的哺乳动物通用内参基因，所述内参基因为PPIP5K2基因。
[0011]第二方面，本专利技术涉及一种用于检测PPIP5K2内参基因的引物，上游引物为CATTGGCTTTCACATCCAGT，下游引物为ACCTTTTAACAGCAGAACCG。
[0012]第三方面，本专利技术涉及一种用于检测PPIP5K2内参基因的探针，探针为CTTGTGGAACAGAAGCAGAATCCTACTG。
[0013]第四方面，本专利技术涉及一种用于检测PPIP5K2内参基因在制备动物病原体RNA核酸扩增检测产品中的应用，所述产品中包括用于检测所述内参基因的引物和探针。
[0014]第五方面，本专利技术涉及一种用于哺乳动物病原体RNA 核酸扩增检测的试剂盒，包括用于检测PPIP5K2内参基因的引物和探针；上游引物为CATTGGCTTTCACATCCAGT，下游引物为ACCTTTTAACAGCAGAACCG；探针为CTTGTGGAACAGAAGCAGAATCCTACTG。
[0015]作为本专利技术的一个实施方案，所述核酸扩增检测包括反转录
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实时荧光定量PCR检测、反转录
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普通PCR检测、反转录
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环介导等温扩增检测、反转录
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依赖核酸序列的扩增检测、反转录
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滚环扩增检测、反转录
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单引物等温扩增检测、反转录
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依赖解旋酶DNA等温扩增、反转录
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重组酶聚合酶扩增、反转录
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链替代扩增中的任一种。
[0016]作为本专利技术的一个实施方案，所述哺乳动物包括但不限于人、猪、鼠、牛、羊、猫、狗。
[0017]作为本专利技术的一个实施方案，所述哺乳动物病原体包括但不限于口蹄疫病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒、冠状病毒、汉坦病毒。
[0018]作为本专利技术的一个实施方案，所述试剂盒用于扩增哺乳动物不同组织提取RNA。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0020]1)本专利技术首次提出在哺乳动物RNA病毒PCR检测中建立通用的内参基因。
[0021]2)本专利技术首次提出将动物的PPIP5K2基因作为内参基因用于哺乳动物病原体RNA的RT
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PCR检测。
[0022]3)本专利技术提出的检测引物，克服了针对普通的内参基因引物仅能适应一种动物的缺陷，使得应用本引物的试剂盒可适用于多种动物内参的检测，大大提高了样本适用范围，提升了检测效率。
附图说明
[0023]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0024]图1为实施例2的引物对猪肌肉RNA进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，左侧为Marker，从下往上分别是100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp，1
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6对应的引物组合分别是对应的引物组合分别是PUM2
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1，PPIP5K2
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1，EHBP1
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1(96bp)，PUM2
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2，PPIP5K2
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2(144bp)，EHBP1
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2(86bp)。
[0025]图2为PPIP5K2基因内参引物与3种动物基因序列的匹配情况。
[0026]图3为EHBP1基因内参引物与3种动物基因序列的匹配情况。
[0027]图4为RP基因内参引物与3种动物基因序列的匹配情况。
[0028]图5为GAP基因内参引物与3种动物基因序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于动物病原体RNA核酸扩增检测的哺乳动物通用内参基因，所述内参基因为PPIP5K2基因。2.一种用于检测权利要求1所述的PPIP5K2内参基因的引物，其特征在于，上游引物为CATTGGCTTTCACATCCAGT，下游引物为ACCTTTTAACAGCAGAACCG。3.一种用于检测权利要求1所述的内参基因的探针，其特征在于，探针为CTTGTGGAACAGAAGCAGAATCCTACTG。4.一种用于检测权利要求1所述的内参基因在制备动物病原体RNA核酸扩增检测产品中的应用，所述产品中包括用于检测所述内参基因的引物和探针。5.一种用于哺乳动物病原体RNA核酸扩增检测的试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1所述的内参基因的引物和探针；上游引物为CATTGGCTTTCACATCCAGT，下游引物为ACCTTTTAACAGCAGAACCG；探针为CTTGTGGAACAGAAGCAGAATCCTACTG。6.根据权利要求5所述的用于哺乳动物病原体RNA核酸扩增检测的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增检测包括反转录

【专利技术属性】
技术研发人员：陈诚，张震，仲从浩，王科，焦文龙，殷波，丁举静，林烨，范可心，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：