一种快速鉴定外源cop-GFP的方法技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，本发明专利技术提供了一种快速鉴定外源cop

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定外源cop
‑
GFP的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种快速鉴定外源cop
‑
GFP的方法。

技术介绍

[0002]cop
‑
GFP是一种加强荧光蛋白，在动物体内表达后发绿色荧光。通常是作为一种报告基因来检测基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。通常cop
‑
GFP的表达鉴定方法主要包括：将外源基因转到动物体内后在48～72小时是使用荧光倒置显微镜观察绿色荧光的表达，或者是用流式细胞仪或者是紫外分光光度计来判断荧光蛋白的表达。然而，使用荧光显微镜观察虽可以判断细胞是否有绿色荧光蛋白的表达，但是无法定量判断荧光基因表达量的高低，使用流式细胞仪检测cop
‑
GFP绿色荧光的表达，虽然准确效率高而且能够定量分析，准确判断荧光表达量的高低，但是需要抗体和流式细胞仪所需设备条件较为苛刻，而且无法检测体外的外源的cop
‑
GFP的表达。因此，需要提供一种较为快捷、稳定的可以同时定性并且定量的方法来检测cop
‑
GFP基因的表达。

技术实现思路

[0003]为克服现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术提供了一种快速鉴定外源cop
‑
GFP的方法。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种快速鉴定外源cop
‑
GFP的方法，包括如下步骤：
[0006](1)根据cop
‑
GFP的DNA序列设计合成地高辛探针；
[0007](2)使用离心柱纯化法提取待测样本的DNA；
[0008](3)将所述待测样本的DNA进行煮沸处理后加到薄膜上；
[0009](4)待膜风干后置于2
×
SSC缓冲液中浸泡；
[0010](5)浸泡结束后使用紫外交联将DNA固定在膜上；
[0011](6)固定结束后将膜DNA面与预杂交液混合进行预杂交，得预杂交膜；
[0012](7)将步骤(1)所得地高辛探针进行煮沸变性后冷却，然后与杂交液混合，得混合液2；
[0013](8)将步骤(6)所得预杂交膜与步骤(7)所得混合液混合进行杂交过夜，然后使用0.5
×
SSC溶液进行漂洗，得探针交联膜；
[0014](9)使用核酸检测试剂盒对所述探针交联膜进行显影实验。
[0015]优选的，步骤(1)中所述cop
‑
GFP的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0016]优选的，步骤(1)中所述地高辛探针的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]优选的，步骤(2)中所述待测样本的DNA的提取浓度≥100ng/μl。
[0018]优选的，步骤(3)中所述煮沸处理的时间为4～6min，步骤(3)中所述薄膜包括硝酸纤维素膜或尼龙膜，步骤(4)中所述浸泡的时间为15～25min。
[0019]优选的，步骤(5)中所述紫外交联的时间为55～65s。
[0020]优选的，步骤(6)中所述预杂交液包括如下组分：25～35ml20
×
SSC缓冲液，8～12ml50
×
Denhardt
’
s，4～6ml10
×
SDS，0.5～1.5mlSalmonDNA和50～55mldH2O，所述SalmonDNA的浓度为8～12mg/ml，所述预杂交液的用量为占膜面积的1～2ml/cm2，所述预杂交的温度为55～65℃，所述预杂交的时间为3.5～4.5h。
[0021]优选的，步骤(7)中所述煮沸变性的时间为4～6min，所述杂交液包括如下组分：25～35ml20
×
SSC缓冲液，8～12ml50
×
Denhardt
’
s，4～6ml10
×
SDS和50～55mldH2O，所述杂交液的用量为占膜面积的4～6ml/cm2。
[0022]优选的，步骤(8)中所述杂交的温度为55～65℃，所述0.5
×
SSC溶液含有8～12％的SDS，所述漂洗的次数为1～3次，每次漂洗的时间为15～25min。
[0023]优选的，步骤(9)中所述核酸检测试剂盒包括化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0025]本专利技术可以较快地检测到cop
‑
GFP绿色荧光在细胞内的表达。且本专利技术可以一次检测多个样品，并且后续可以通过斑点印迹分析cop
‑
GFP在细胞内的表达量。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0027]图1为本专利技术的地高辛探针设计序列；
[0028]图2为本专利技术实施例1的显影结果。
具体实施方式
[0029]本专利技术提供了一种快速鉴定外源cop
‑
GFP的方法，包括如下步骤：
[0030](1)根据cop
‑
GFP的DNA序列设计合成地高辛探针；
[0031](2)使用离心柱纯化法提取待测样本的DNA；
[0032](3)将所述待测样本的DNA进行煮沸处理后加到薄膜上；
[0033](4)待膜风干后置于2
×
SSC缓冲液中浸泡；
[0034](5)浸泡结束后使用紫外交联将DNA固定在膜上；
[0035](6)固定结束后将膜DNA面与预杂交液混合进行预杂交，得预杂交膜；
[0036](7)将步骤(1)所得地高辛探针进行煮沸变性后冷却，然后与杂交液混合，得混合液2；
[0037](8)将步骤(6)所得预杂交膜与步骤(7)所得混合液混合进行杂交过夜，然后使用0.5
×
SSC缓冲液和SDS溶液进行漂洗，得探针交联膜；
[0038](9)使用核酸检测试剂盒对所述探针交联膜进行显影实验。
[0039]在本专利技术中，步骤(1)中所述cop
‑
GFP的DNA序列优选如SEQ ID NO.1所示。
[0040]在本专利技术中，步骤(1)中所述地高辛探针的DNA序列优选如SEQ IDNO.2所示。
[0041]在本专利技术中，步骤(2)中所述待测样本的DNA的提取浓度优选≥100ng/μl。
[0042]在本专利技术中，步骤(3)中所述煮沸处理的时间优选为4～6min，进一步优选为5min；步骤(3)中所述薄膜优选包括硝酸纤维素膜或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定外源cop
‑
GFP的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据cop
‑
GFP的DNA序列设计合成地高辛探针；(2)使用离心柱纯化法提取待测样本的DNA；(3)将所述待测样本的DNA进行煮沸处理后加到薄膜上；(4)待膜风干后置于2
×
SSC缓冲液中浸泡；(5)浸泡结束后使用紫外交联将DNA固定在膜上；(6)固定结束后将膜DNA面与预杂交液混合进行预杂交，得预杂交膜；(7)将步骤(1)所得地高辛探针进行煮沸变性后冷却，然后与杂交液混合，得混合液；(8)将步骤(6)所得预杂交膜与步骤(7)所得混合液混合进行杂交过夜，然后使用0.5
×
SSC溶液进行漂洗，得探针交联膜；(9)使用核酸检测试剂盒对所述探针交联膜进行显影实验。2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop
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GFP的方法，其特征在于，步骤(1)中所述cop
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GFP的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop
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GFP的方法，其特征在于，步骤(1)中所述地高辛探针的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop
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GFP的方法，其特征在于，步骤(2)中所述待测样本的DNA的提取浓度≥100ng/μl。5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop
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GFP的方法，其特征在于，步骤(3)中所述煮沸处理的时间为4～6min，步骤(3)中所述薄膜包括硝酸纤维素膜或尼龙膜，步骤(4)中所述浸泡的时间为15～25min。6.根据权利要求1所述的一种快速鉴定外源cop
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【专利技术属性】
技术研发人员：靳锴，高嘉晨，左其生，韩威，陈国宏，李碧春，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：