基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，所述试剂盒包括了RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因的表达，所述相关基因包括TRPV1基因、SP基因、NGF基因和TNF

【技术实现步骤摘要】
基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于化妆品原料筛选
，具体涉及一种基于斑马鱼模型中TRPV1 信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]瞬时感受器电位香草酸亚型1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1) 是初级感受神经上对物理和化学刺激产生疼痛作用的靶点，在人表皮角质形成细胞、人表皮永生化角质形成细胞系等广泛分布的皮肤细胞和伤害性感受器中均有表达，与局部皮肤瘙痒、疼痛的发生密切相关。当表达在皮肤感觉传入纤维末端的TRPV1通道激活后，促进轴突内囊泡胞吐释放大量神经肽，如P物质(Substance P，SP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene Related Peptide,CGRP)等神经源性炎症因子。这些神经肽可激活多种皮肤细胞(如角质细胞、抗原呈递细胞、皮脂腺细胞、成纤维细胞等)，最终导致皮肤神经源性炎症。因此，筛选出高效、温和的TRPV1抑制剂用于皮肤舒缓具有重要意义。
[0003]TRPV1可被辣椒素和其他香草酸类化合物、炎性介质(如花生四烯酸代谢物)、热(＞43℃)、酸(pH＜5.3)、细胞外渗透压的改变等多种理化因素直接激活，通过介导Ca2+内流，参与细胞新陈代谢和信号传递等生理活动。缓激肽、前列腺素E2、神经生长因子等内源性介质可以通过介导蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、磷酯酶C(PLC)等胞内级联信号使TRPV1特定结构磷酸化，敏化TRPV1从而降低其激活阈值。神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)在皮肤、免疫细胞和其它组织中广泛存在。在炎症反应中，NGF与酪氨酸激酶受体(TrkA) 结合激活PKA、PKC、ERK/MAPK、PI3K通路使TRPV1通道敏化,导致热痛觉过敏；此外NGF还能通过激活并磷酸化p38MAPK信号通路增强TRPV1蛋白的表达水平。肿瘤坏死因子
‑
α(Tumor Necrosis Factor
‑
α,TNF
‑
α)是一种重要的炎性介质。当皮肤感觉传入纤维的TRPV1通道激活时，释放的SP和CGRP等神经肽可以诱导单核巨噬细胞、NK细胞和T淋巴细胞产生TNF
‑
α，它可以激活丝裂原活化蛋白激酶 (p38
‑
MAPK)信号通路，改变细胞膜通透性，使Na+内流，降低兴奋阈值,加剧疼痛反应。
[0004]与其它常用的鼠、兔等动物模型相比，斑马鱼模型具有以下独特优势：(1)斑马鱼基因组已被完全测序，与人类基因组有70％
–
80％的同源性；(2)斑马鱼物种稳定，个体差异小；(3)体积小，繁殖能力强，易于培养，可获得较大样本量，实验周期短。斑马鱼可以模拟皮肤细胞、神经细胞和免疫细胞共同参与的神经源性炎症，是理想的实验模型。
[0005]现有技术中，对于化妆品舒缓功效评价常用HaCaT细胞和3D皮肤模型等皮肤细胞，此类方式难以检测皮肤感受器感知的疼痛刺激，对化妆品舒缓功效的评价不够全面。

技术实现思路

[0006]鉴于上述问题，本专利技术的第一个目的是设计一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，以检测TRPV1、SP、NGF和TNF
‑
α等相关基因mRNA表达；第
二个目的是使用上述试剂盒实现TRPV1信号通路抑制剂的化妆品原料快速筛选，筛选出皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和 qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因表达，所述相关基因包括TRPV1基因、SP 基因、NGF基因和TNF
‑
α基因中的至少一种。
[0008]进一步地，用于检测TRPV1基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：1
‑
2所示：
[0009]Forward：5
’‑
ATGCAGGGTTTACATGAGTATCTC
‑3’
；
[0010]Reverse：5
’‑
GTCGGTGTAAGCAGCATTGATA
‑3’
。
[0011]进一步地，用于检测SP基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：3
‑
4所示：
[0012]Forward：5
’‑
CAAGAAGAGCCAGAGTCGTATG
‑3’
；
[0013]Reverse：5
’‑
CTTTTGGGAGCGAATGTGAA
‑3’
。
[0014]进一步地，用于检测NGF基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：5
‑
6所示：
[0015]Forward：5
’‑
CGCTGACTTCATTCAAGAACC
‑3’
；
[0016]Reverse：5
’‑
GGAAAACATCCACCATCACATAC
‑3’
。
[0017]进一步地，用于检测TNF
‑
α基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：7
‑
8所示：
[0018]Forward：5
’‑
ATCTTCAAAGTCGGGTGTATGG
‑3’
；
[0019]Reverse：5
’‑
GATTGCCCTGGGTCTTATGG
‑3’
。
[0020]本专利技术还提供一种上述试剂盒的应用，通过建立斑马鱼模型，使用所述试剂盒筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
[0021]进一步地，通过建立斑马鱼模型筛选出TRPV1信号通路的抑制剂，以筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料。
[0022]进一步地，所述斑马鱼模型是使用斑马鱼AB品系，通过LPS诱导建立相关模型。
[0023]进一步地，使用所述试剂盒筛选皮肤疼痛舒缓的化妆品原料的方法，包括如下步骤：
[0024](1)培养斑马鱼，并分别设置模型组、对照组和样品处理组，其中，模型组和样品处理组是将受精24hpf的斑马鱼胚胎转移至含有LPS胚胎培养液中进行诱导，对照组是将24hpf的斑马鱼胚胎转移至不含LPS的胚胎培养液中培养。
[0025](2)向样品处理组的培养液中分别加入待筛选的化妆品原料，化妆品原料浓度为安全浓度，继续培养；
[0026](3)使用所述试剂盒，对模型组、对照组和样品处理组的斑马鱼胚胎进行RNA 的提取和纯化、逆转录、PCR扩增后，通过检测并分析化妆品原料对相关基因mRNA 表达的影响，以筛选化妆品原料。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于斑马鱼模型中TRPV1信号通路筛选皮肤疼痛舒缓原料的试剂盒，其特征在于，包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、特异性引物和qPCR反应体系试剂，用于检测相关基因的表达，所述相关基因包括TRPV1基因、SP基因、NGF基因和TNF
‑
α基因中的至少一种。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测TRPV1基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：1
‑
2所示：Forward：5
’‑
ATGCAGGGTTTACATGAGTATCTC
‑3’
；Reverse：5
’‑
GTCGGTGTAAGCAGCATTGATA
‑3’
。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测SP基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：3
‑
4所示：Forward：5
’‑
CAAGAAGAGCCAGAGTCGTATG
‑3’
；Reverse：5
’‑
CTTTTGGGAGCGAATGTGAA
‑3’
。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测NGF基因表达的特异性引物序列如SEQ ID NO：5
‑
6所示：Forward：5
’‑
CGCTGACTTCATTCAAGAACC
‑3’
；Reverse：5
’‑
GGAAAACATCCACCATCACA...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋旭峰，张阳，夏博伟，陆槿，韩新彬，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：