检测质粒polyA尾长度的引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测质粒polyA尾长度的引物和方法，所述引物包括：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物，和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的反向引物。在本发明专利技术中，设计了针对质粒polyA尾进行扩增的引物，可以特异性扩增质粒polyA尾；提取质粒对质粒polyA尾PCR扩增后，即可通过琼脂糖凝胶电泳检测分析polyA尾长度，其对比Sanger测序法，所需时间减少和成本均大幅度减少，准确性基本能与Sanger测序法保持一致。性基本能与Sanger测序法保持一致。性基本能与Sanger测序法保持一致。

【技术实现步骤摘要】
检测质粒polyA尾长度的引物和方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，更具体地，本专利技术涉及一种检测质粒polyA尾长度的引物、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]发现mRNA的3
’
端带有polyA尾已有几十年的历史，期间的研究已经证实polyA尾为调节mRNA翻译和稳定性的核心因子。
[0003]在mRNA体外合成中，当前普遍的做法是质粒模板中polyA尾经体外转录来实现mRNA中polyA尾的添加。
[0004]mRNA中polyA尾长度取决于质粒中polyA尾长度，而质粒polyA尾序列在宿主菌培养过程中经常会发生碱基丢失，造成polyA尾缩短的现象，因此对于质粒中polyA尾长度进行确认十分重要。当前质粒polyA尾长度的检测方法主要以Sanger测序为主，但是测序周期较长，成本也高。因此，提供一种简单快捷且准确性高的测定质粒polyA尾长度的方法非常有意义。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的在于提供一种检测质粒polyA尾长度的引物、试剂盒及方法。
[0006]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种检测质粒polyA尾长度的引物，包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物，和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的反向引物。
[0008]本专利技术的第二方面，提供了一种检测质粒polyA尾长度的试剂盒，包括上述检测质粒polyA尾长度的引物。
[0009]本专利技术的第三方面，提供了一种检测质粒polyA尾长度的方法，包括以下步骤：采用上述检测质粒polyA尾的引物，对待测质粒进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测。
[0010]在本专利技术中，设计了针对质粒polyA尾进行扩增的引物，可以特异性扩增质粒polyA尾；提取质粒对质粒polyA尾PCR扩增后，即可通过琼脂糖凝胶电泳检测分析polyA尾长度，其对比Sanger测序法，所需时间减少和成本均大幅度减少，准确性基本能与Sanger测序法保持一致。
附图说明
[0011]图1为本专利技术试验例1中各组引物对进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，marker为50bp DNALadder。
具体实施方式
[0012]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0013]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0014]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0015]本专利技术的其中一些实施例中，公开了一种检测质粒polyA尾长度的引物，包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物，和序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的反向引物。采用引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3、引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4、引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5对质粒polyA尾进行扩增，特异性强，没有明显的杂带，条带聚合度高，均一性强。
[0016]在其中一些实施例中，所述引物包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物，和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
[0017]在其中一些实施例中，所述质粒的3'UTR区域为HBB UTR。
[0018]在本专利技术的另一些实施例中，公开了一种检测质粒polyA尾长度的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测质粒polyA尾长度的引物。
[0019]在其中一些实施例中，所述引物中的正向引物和反向引物的工作浓度均为8uM～12uM。
[0020]在本专利技术的另一些实施例中，公开了一种检测质粒polyA尾的方法，包括以下步骤：采用上述检测质粒polyA尾的引物，对待测质粒进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测。
[0021]在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系包括：待测质粒样品0.8～1.2uL、正向引物0.8～1.2uL、反向引物0.8～1.2uL、TaqPCRMasterMix 8～12uL，无酶水加至20uL。
[0022]在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃，30s，56℃，30s，72℃，10s；循环30次。
[0023]以下结合附图和具体实施例来详细说明本专利技术。
[0024]实施例1质粒polyA尾的特异性扩增引物
[0025]针对3'UTR区域为HBB UTR的质粒，设计特异性扩增引物，正向引物设计在3'UTR上，反向引物设计在质粒载体上，特异性扩增引物包括：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物，和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的反向引物。具体的引物序列如表1所示。
[0026]表1
[0027]序号引物名称引物长度引物序列(5'
‑
3')1F121CATTTATTTTCATTGCTCGAG(SEQ ID NO.1)
2R120AGTCGACGAATTCGCTCTTC(SEQ ID NO.2)3R223ACAGCTATGACCATGATTACGCC(SEQ ID NO.3)4R322CAGGAAACAGCTATGACCATGA(SEQ ID NO.4)5R423GCGGATAACAATTTCACACAGGA(SEQ ID NO.5)
[0028]实施例2检测质粒polyA尾的方法
[0029]1、配制PCR反应体系，如表2所示。
[0030]表2
[0031]序号组分名称体积1待测质粒样品1uL2F
‑
引物(10uM)1uL3R
‑
引物(10uM)1uL42xTaqPCRMasterMix10uL5无酶水7uL6总体系20uL
[0032]2、PCR扩增
[0033]变性温度94℃，变性时间30s，退火温度56℃，退火时间30s，延伸温度72℃，延伸时间10s；此三个步骤循环30次。
[0034]3、取PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测质粒polyA尾长度的引物，其特征在于，所述引物包括：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物，和序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的反向引物。2.根据权利要求1所述的检测质粒polyA尾长度的引物，其特征在于，所述引物包括：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物，和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。3.根据权利要求1或2所述的检测质粒polyA尾长度的引物，其特征在于，所述质粒的3'UTR区域为HBBUTR。4.权利要求1～3任一项所述的引物在制备检测质粒polyA尾长度的试剂盒中的应用。5.一种检测质粒polyA尾长度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的检测质粒polyA尾长度的引物。6.根据权利要求5所述的检测质粒polyA尾长度的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘有东，张琼，朱蕾，刘浩，万季，赵钊，王弈，
申请(专利权)人：广州市新合生物医疗科技有限公司深圳市新合生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：