去外泌体牛血清的生产制备工艺制造技术

本发明专利技术涉及牛血清技术领域，具体涉及去外泌体牛血清的生产制备工艺，本发明专利技术采用两种方法，第一种是超速离心的方法去除牛血清中外泌体颗粒；第二种是用超滤的方法去除牛血清中的外泌体颗粒，两种方法均可有效去除90％以上的外泌体颗粒，满足科研和生产对去外泌体牛血清的需求；对比进口去外泌体胎牛血清，本发明专利技术通过原料优化和超滤方法得到的去外泌体血清在外泌体数量为进口去外泌体胎牛血清的53％，细胞培养方面(促细胞增殖和传代功能，促细胞贴壁、增殖方面)也要优于进口去外泌体胎牛血清。壁、增殖方面)也要优于进口去外泌体胎牛血清。壁、增殖方面)也要优于进口去外泌体胎牛血清。

【技术实现步骤摘要】
去外泌体牛血清的生产制备工艺


[0001]本专利技术涉及牛血清
，具体涉及去外泌体牛血清的生产制备工艺。

技术介绍

[0002]牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能，牛血清提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物，牛血清提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力，牛血清在有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用，牛血清是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源，牛血清起酸碱度缓冲液作用，牛血清提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害等优点。胎牛血清和新生牛血清是疫苗企业、生物制药企业、诊断企业和科研院校的生产和研究中重要的原辅材料。
[0003]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30
‑
150nm)，现今，其特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
[0004]目前国内在做外泌体研究时，通过采购进口的去外泌体胎牛血清满足实验和生产的需求。国内没有规模生产这类胎牛血清的经验。本专利通过原理分析在进行实验，最后到规模稳定生产出去外泌体胎牛血清。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供两种不同的方法：一种是超速离心(16，000g,4小时)的方法去除牛血清中外泌体颗粒；第二种是用超滤(100kD)的方法去除牛血清中的外泌体颗粒，得到外泌体含量低，但培养效果好的胎牛血清或新生牛血清；
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术第一个方面公开了两种去外泌体牛血清的生产制备工艺，
[0008]第一种方法为，利用100
‑
300KD的超滤膜对样品牛血清进行超滤，超滤完成后，收集得到的去外泌体血清。
[0009]优选地，超滤过程优选100
‑
200KD的超滤膜。
[0010]更优选地，用100KD的超滤膜包超滤100000ml样品牛血清到超滤不动为止，收集穿透。
[0011]第二种方法为，利用超速离心机在100000g
‑
200000g的离心力对样品牛血清离心
4
‑
24h，离心完成后收集得到去外泌体血清。
[0012]优选地，所述超速离心机选用为贝克曼超速离心机。
[0013]优选地，超速离心机工作温度在2
‑
8℃下。
[0014]本专利技术第二个方面公开了在对上述样品牛血清去除外泌体前，对样品牛血清进行预处理的方法，进一步降低样品牛血清中的总粒子浓度和外泌体浓度；所述样品牛血清在去外泌体前预处理具体方法为：取采血牛300
‑
500ml血清，将得到的血清经过3000
‑
4000转，30
‑
60min离心后，收集封存得到样品牛血清。专利技术人发现对采血牛采集后半段血清时，牛的应激反应大，分泌至血清的外泌体更多，我们通过采集前半段胎牛血清混合降低原料的外泌体数量。
[0015]本专利技术第三个方面公开了上述去外泌体牛血清在细胞培养中的用途。
[0016]通过本专利技术的技术方案，本专利技术采用两种方法，第一种是超速离心的方法去除牛血清中外泌体颗粒；第二种是用超滤的方法去除牛血清中的外泌体颗粒，两种方法均可有效去除90％以上的外泌体颗粒；对比进口去外泌体胎牛血清，本专利技术通过原料优化和超滤方法得到的去外泌体血清在外泌体数量为进口去外泌体胎牛血清的53％，细胞培养方面(促细胞增殖和传代功能，促细胞贴壁、增殖方面)也要优于进口去外泌体胎牛血清。
附图说明
[0017]图1
‑
3为本专利技术实施例1样品1粒径和浓度分析分析图；
[0018]图4
‑
6为本专利技术实施例1样品2粒径和浓度分析分析图；
[0019]图7
‑
9为本专利技术实施例2胎牛血清(未去外泌体)的粒径和浓度分析分析图；
[0020]图10
‑
12为本专利技术实施例2超滤后去外泌体血清的粒径和浓度分析分析图；
[0021]图13
‑
15为本专利技术实施例2去外泌体进口血清的粒径和浓度分析分析图；
[0022]图16
‑
18为本专利技术实施例3胎牛血清(未去外泌体)的粒径和浓度分析分析图；
[0023]图19
‑
21为本专利技术实施例3超高速离心后去外泌体血清的粒径和浓度分析分析图；
[0024]图22为本专利技术实施例4中293细胞在胎牛血清培养24h后的显微图；
[0025]图23为本专利技术实施例4中293细胞在去外泌体(100KD超滤)血清培养24h后的显微图；
[0026]图24为本专利技术实施例4中293细胞在去外泌体(超高速离心)血清培养24h后的显微图；
[0027]图25为本专利技术实施例4中293细胞在进口去外泌体血清培养24h后的显微图；
[0028]图26为本专利技术实施例4中293细胞在胎牛血清培养48h后的显微图；
[0029]图27为本专利技术实施例4中293细胞在去外泌体(100KD超滤)血清培养48h后的显微图；
[0030]图28为本专利技术实施例4中293细胞在去外泌体(超高速离心)血清培养48h后的显微图；
[0031]图29为本专利技术实施例4中293细胞在进口去外泌体血清培养48h后的显微图。
具体实施方式
[0032]下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案进行详细描述，但并不因此将本专利技术
限制在所述的实施例范围之中。
[0033]本申请实施例中未注明的工艺参数，均可依照常规方法进行，所用原料均可通过商业渠道获得。
[0034]实施例1：原料生产工艺比较
[0035]1.将采血牛运到采血车间，采血针连接好导血管，牛血清流速调至流速最大，开始采血，当第一个采血袋血清充满500ml后，再将牛血清流至第二个采血袋，将两个采血袋封好，分别在3000转下进行30分钟离心。离心完成后，牛血清通过虹吸进入下面牛血清原料储存袋。将管子口封好，牛血清原料
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去外泌体牛血清的生产制备工艺，其特征在于，利用100
‑
300KD的超滤膜对样品牛血清进行超滤，超滤完成后，收集得到的去外泌体血清。2.根据权利要求1所述的一种去外泌体牛血清的生产制备工艺，其特征在于，超滤过程优选100
‑
200KD的超滤膜。3.一种去外泌体牛血清的生产制备工艺，其特征在于，利用超速离心机在100000g
‑
200000g的离心力对样品牛血清离心4
‑
24h，离心完成后收集得到去外泌体血清。4.根据权利要求3所述的去外泌体牛血清的生产制备工艺，其特征在于，所述超速...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，任志斌，陈强，王元，
申请(专利权)人：兰州荣晔生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：