一种利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法技术

本发明专利技术提供一种利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，采用荧光的共振能量转移(FRET)技术对胶束和脂质体的融合过程的荧光信号强度变化进行跟踪检测，通过荧光强弱的变化比值，检测配体胶束在脂质体表面的插入效率，实现了利用后插法制备配体修饰脂质体时插入效率的快速高效的检测。本方法也为针对不同患者进行个性化的精准治疗的多样化配体靶向脂质体的制备，提供了处方工艺优化的快速筛选技术平台，具有创新性，可有效的促进配体靶向脂质体从实验室研究到临床应用的转化。脂质体从实验室研究到临床应用的转化。脂质体从实验室研究到临床应用的转化。

【技术实现步骤摘要】
一种利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法


[0001]本专利技术涉及靶向脂质体融合表征
，具体涉及一种利用荧光FERT效应表征靶向配体在脂膜中插入效率的方法。

技术介绍

[0002]靶向脂质体可以选择性的将药物输送到体内的病变组织，降低药物的毒性，提高药物治疗效果，是一种极具临床应用前景的纳米制剂。但是，如何将靶向配体高效的修饰在脂质体的表面，快速的实现配体靶向脂质体的制备，缩短靶向脂质体的制备时间和降低生产成本，仍然是配体修饰的靶向脂质体新药开发中的难点。
[0003]将具有靶向效果的多肽、糖、抗体片段、抗体、核酸适体修饰到磷脂双分子层结构的脂质体表面，最常见的方式有三种，第一种是先制备表面含有活性基团的前体脂质体，将靶向配体通过简单、易反应的化合键结合的方式与活性基团反应修饰在脂质体的表面；第二种是先制备配体修饰的脂质材料，然后与其他脂质成分混合，利用薄膜分散法或者微流控芯片技术制备靶向配体修饰的脂质体，通过这种方法制备的脂质体，通常配体会均一的分布在脂质体膜的内外两侧；第三种是将配体修饰在胶束的表面，通过优化孵育条件，将靶向配体胶束高效率的插入到脂质体表面，即后插法制备配体修饰的靶向脂质体的方法。
[0004]后插法制备配体修饰的脂质体，可以实现不同靶向配体分子修饰的脂质胶束直接通过简单的一步法孵育完成对已载药脂质体表面的配体靶向修饰，该方法可以显著降低配体靶向脂质体生产的复杂性，和成本控制。无论从实验室研究还是生产的角度，后插法制备靶向脂质体，具有简单、快速、灵活的特点。对不同患者，可快速实现针对特定病变组织的靶向脂质体的配体修饰，提供个性化的精准治疗方案。
[0005]然而，后插法进行的配体表面修饰的脂质体受靶向配体胶束溶液浓度、已载药脂质体的脂膜表面性质、孵育混合时间、混合方式、混合温度、配体的类型等处方工艺参数的影响。Allen TM等在后插法制备配体靶向脂质体方面进行了较为深入的研究。利用后插法制备的PEG修饰的脂质体，在大鼠体内的血液分布半衰期随着DSPE
‑
PEG
1900
摩尔浓度的增加而延长。将3mol％DSPE
‑
PEG
1900
胶束与脂质体(HSPC/CH/DPPG/DTPA
‑
DSPE)共孵育，利用Sepharose4B column chromatography和HPLC的方法检测修饰到脂质体表面DSPE
‑
PEG
1900
的含量，60℃孵育1h，可以基本上实现DSPE
‑
PEG
1900
胶束100％插入率。如果脂质体的表面已经有mPEG
2000
‑
DSPE修饰，IgG
‑
mPEG
2000
‑
DSPE/mPEG
2000
‑
DSPE胶束通过孵育修饰到PEG化脂质体(HSPC/CHOL)表面的插入效率就会明显下降。当选用低相变温度磷脂制备PEG修饰的脂质体(EPC/CHOL/DSPE
‑
PEG
2000
)时，D4
‑
PEG
2000
‑
DSPE在脂质体的表面修饰密度随着共孵育的DSPE
‑
PEG
2000
‑
D4胶束浓度的增加而增加，但是当DSPE
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PEG2000
‑
D4胶束摩尔浓度大于5％时，DSPE
‑
PEG2000
‑
D4在脂质体表面的修饰密度达1.6％，插入效率为32％,占总脂质的百分摩尔浓度比0.8％左右。后插法制备配体靶向脂质体，配体脂质胶束插入效率的计算，多采用葡聚糖凝胶色谱柱Sepharose CL
‑
4B分离脂质体和胶束，对比孵育前后分离获得的脂质体和配体胶束的含量，检测方法有放射性核素标记、HPLC
‑
ELSD/UV、荧光分光光度法。
[0006]现有的葡聚糖凝胶色谱(Sepharose CL
‑
4B columns)的方法是根据脂质体与胶束的粒径大小的不同，进行的分离。对未经配体修饰的脂质体的粒径分布的离散度(PDI)的要求高，当小粒经脂质体或磷脂碎片增多时，也较难与胶束分离。使最终测定的配体插入效率的计算结果偏差大。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，采用荧光的共振能量转移(FRET)技术对胶束和脂质体的融合过程进行荧光信号强度变化的示踪检测，利用供体荧光分子和受体荧光分子的荧光信号强弱变化，建立荧光分析方法监测配体胶束与脂质体的融合过程，配体胶束在脂质体膜表面的插入效率。FERT技术为配体靶向脂质体的制备提供了处方工艺的快速筛选平台，为针对不同患者的个性化精准治疗提供可能，可有效的促进配体靶向脂质体的临床转化。
[0008]本专利技术提供一种利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，包括如下步骤：
[0009]步骤一、采用第一荧光染料标记胶束，采用第二荧光染料标记脂质体；
[0010]步骤二、将第一荧光染料标记的胶束和第二荧光染料标记的脂质体融合，观察第一荧光染料和/或第二荧光染料的荧光强度。
[0011]进一步优选地，所述第一荧光染料和第二荧光染料均为具有共振能量转移效应的荧光染料。
[0012]进一步优选地，所述第一荧光染料和第二荧光染料均独立地选自DiO、DiI中的至少一种。
[0013]进一步优选地，所述第一荧光染料为DiO；所述第二荧光染料为DiI；
[0014]所述第一荧光染料为供体荧光分子；
[0015]所述第二荧光染料为受体荧光分子。
[0016]DiO标记胶束与脂质体的融合，并不限于是哪一种脂质胶束，DiO标记的任何疏水结构都算。
[0017]进一步优选地，所述DiO的浓度为0.0001
‑
5μM；所述DiI的浓度为0.0001
‑
5μM；
[0018]所述DiO和DiI的浓度摩尔比为0.00001
‑
5.0。
[0019]进一步优选地，所述DiO的浓度为0.001
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1μM；所述DiI的浓度为0.001
‑
1μM；
[0020]所述DiO和DiI的浓度摩尔比为0.0001
‑
1.5。
[0021]进一步优选地，所述胶束为DSPE
‑
MPEG胶束、DSPE
‑
MPEG
‑
GE11胶束、DSPE
‑
MPEG/DSPE
‑
MPEG
‑
GE11(PEG/GE11胶束)混合胶束中的至少一种；
[0022]所述脂质体为姜黄素脂质体、空白脂质体中的至少一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、采用第一荧光染料标记胶束，采用第二荧光染料标记脂质体；步骤二、将第一荧光染料标记的胶束和第二荧光染料标记的脂质体融合，观察第一荧光染料和/或第二荧光染料的荧光强度。2.根据权利要求1所述的利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，其特征在于，所述第一荧光染料和第二荧光染料均为具有共振能量转移效应的荧光染料。3.根据权利要求2所述的利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，其特征在于，所述第一荧光染料和第二荧光染料均独立地选自DiO、DiI中的至少一种。4.根据权利要求3所述的利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，其特征在于，所述第一荧光染料为DiO；所述第二荧光染料为DiI；所述第一荧光染料为供体荧光分子；所述第二荧光染料为受体荧光分子。5.根据权利要求4所述的利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，其特征在于，所述DiO的浓度为0.0001
‑
5μM；所述DiI的浓度为0.0001
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5μM；所述DiO和DiI的浓度摩尔比为0.00001
‑
5.0。6.根据权利要求5所述的利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，其特征在于，所述DiO的浓度为0.001
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1.0μM；所述DiI的浓度为0.001
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1.0μM；所述DiO和DiI的浓度摩尔比为0.0001
‑
1.5。7.根据权利要求1所述的利用荧光FERT效应表征配体插入效率的方法，其特征在于，所述胶束为DSPE
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MPEG胶束、DSPE
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MPEG
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GE11胶束、DSPE
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MPEG/DSPE
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MP...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐海玲，相世栋，
申请(专利权)人：唐海玲，
类型：发明
国别省市：