基于配体浓度梯度驱动磷脂膜化学趋向的亲和分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于配体浓度梯度驱动磷脂膜化学趋向的亲和分析方法。所述的亲和分析方法可以在不需要标记目标分子的情况下分析磷脂膜界面上的亲和作用。通过微流控系统建立磷脂膜界面上方的配体梯度，而磷脂分子将作为受体将受到配体结合作用的驱动，磷脂膜通过电荷和化学特异性相互作用来指导磷脂分子的微米级趋向运动。在这种情况下，磷脂受体的趋向运动将慢慢进行，直到熵和其他分子间作用力完全平衡。通过染料标记受体磷脂，并观测膜中受体分子聚集的最终状态，结合数理统计，便可进行配受体之间微妙和瞬态相互作用的定量表征。征。征。

【技术实现步骤摘要】
基于配体浓度梯度驱动磷脂膜化学趋向的亲和分析方法


[0001]本专利技术属于生化分析
，尤其涉及一种基于配体浓度梯度驱动磷脂膜化学趋向的亲和分析方法。

技术介绍

[0002]细胞膜和细胞内膜统称为生物膜。生物膜是一个具有特殊功能的半透膜，它具有能量传递、物质传递、信息识别等重要功能，这些功能在维持细胞稳定性、信号的放大转化以及生物大分子的合成过程中有着重要作用。尽管磷脂膜普遍参与生化过程，但对膜组织的物理特性知之甚少。磷脂膜难以控制和操纵，而且常规的方法不适于表征具有如此高度的流动性和紊乱的系统。然而，支撑性磷脂双分子层的出现为磷脂膜的精确控制和定量研究及其影响生化过程的机制提供了一系列机会。支撑性磷脂双分子层通常被定义为在固体或聚合物基质上的单个、连续的磷脂双分子层。双层膜可以通过自发吸附和融合单层磷脂脂质体与适当的基底来组装。支撑的双层通常通过薄的水层与固体基质分离，并保留生物膜的许多特性，如横向流动性。
[0003]支撑型脂双层的制备最常用的有两种方法，Langmuir
‑
Blodgett(LB)提拉法和破裂融合法。LB提拉法是由于磷脂具有两亲性，溶解在非极性有机溶剂中时，其亲水性头部基团会位于水相中，疏水尾部区域会随着有机溶剂的蒸发暴露在空气中，此时向上提拉亲水性基质，空气/水界面交界处的膜会吸附在基质上，形成单层磷脂膜。破裂融合法基于磷脂的自组装，将提前制备好脂质体溶液，其中有大量的脂质体会自动吸附在固相基底上随后破裂连结，形成大片完整的磷脂双层膜，疏水效应驱动了脂质体在固相载体上的过程。
[0004]配体
‑
受体结合在化学和生物科学中无处不在，监测这种相互作用通常是通过荧光标记感兴趣的蛋白质、核苷酸或其他目标物来进行的。实际上，荧光标记已经成为检测生物分子的标准工具。然而，蛋白质标记可能会干扰检测过程，并且使用不便，这一直是研究者们迫切开发能够以无标记方式检测生物分析物的检测技术的主要原因。迄今为止，检测技术包括液晶相变、胶体粒子相变、石英晶体微天平测量和表面等离子体共振光谱/成像等。然而，尽管在无标记检测方面取得了巨大进展，没有任何技术可以提供基于荧光信号的灵敏度和灵活性。实际上，荧光信号测量通常可以降低到单分子水平，而不需要后续的信号放大步骤。此外，基于荧光的设备提供快速读出。最后，除了蛋白质标记步骤本身之外，荧光光谱和显微镜相对容易执行。上述优点给予了我们一定的启发，即是否可以在不需要标记目标分子的情况下将这种技术用于界面分析物检测。相反，荧光染料将被嵌入到检测平台的表面上，并用作配体
‑
受体结合的通用传感元件。而生物膜作为细胞屏障，具有许多天然的配体，而磷脂分子将作为受体将受到配体结合作用的驱动，磷脂膜通过电荷和化学特异性相互作用来指导磷脂分子的微米级趋向运动。在这种情况下，磷脂受体的趋向运动将慢慢进行，直到熵和其他分子间力完全平衡。随后，膜中受体分子聚集的最终状态，将提供配受体之间微妙和瞬态相互作用的定量表征。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于配体浓度梯度驱动磷脂膜化学趋向的亲和分析方法。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于配体浓度梯度驱动磷脂膜化学趋向的亲和分析方法，该方法基于微流控芯片实现，所述微流控芯片用作反应室，包括PDMS器件和盖玻片，二者无缝粘合；所述PDMS器件设有3个液体入口、1个液体出口和1个液体通道；包括以下步骤：
[0007](1)配制单层脂质体溶液和含特定配体的缓冲溶液；
[0008]所述单层脂质体溶液是通过冻融挤出法制备的，具体为：将含有NBD染料的磷脂溶于缓冲溶液中，经多次冻融过程形成大单层脂质体，再经多次脂质体挤出器挤出，最终形成粒径均一的单层脂质体溶液；
[0009]将特定配体溶于缓冲溶液中，形成含特定配体的缓冲溶液；所述特定配体为钙离子、镁离子或Tim
‑
3蛋白；
[0010](2)将步骤(1)中配制好的脂质体溶液从微流控芯片的液体出口处通入，使其充满微流控芯片，孵育30
‑
60min，经破裂融合形成磷脂膜；
[0011](3)分别从微流控芯片的三个液体入口以相同的流速通入缓冲溶液，持续20
‑
40min，以冲洗磷脂膜上方剩余的脂质体；
[0012](4)将从中间的液体入口通入的缓冲溶液替换为含特定配体的缓冲溶液，且多次替换浓度逐渐升高的含特定配体的缓冲溶液，两侧的缓冲溶液的流速均不变，含特定配体的缓冲溶液的流速与两侧的缓冲溶液的流速保持一致，从而在微流控通道中形成配体浓度梯度；由LED光源激发特定磷脂产生荧光，使用显微镜观察，并经物镜传输至sCMOS相机，定时拍摄微流控通道中的荧光分布，最后通过NIS Elements软件处理分析并进行数值拟合。
[0013]进一步地，所述单层脂质体溶液的浓度范围为0.5
‑
2mg/mL。
[0014]进一步地，所述步骤(4)中，多次替换浓度逐渐升高的含特定配体的缓冲溶液，逐渐替换的浓度为0.01mM、0.1mM、0.5Mm、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、50mM。
[0015]进一步地，所述单层脂质体的成分与质量比为甘油磷脂:胆固醇＝7:3。
[0016]进一步地，所述甘油磷脂包括磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸。
[0017]进一步地，所述缓冲溶液包括TrisHCl溶液、HEPES溶液和MES溶液。
[0018]本专利技术的有益效果如下：
[0019](1)以染料标记的磷脂膜为研究对象，通过微流控系统的特性，在磷脂膜上方建立配体浓度梯度，导致磷脂分子在沿梯度场方向上的二维化学趋向。
[0020](2)通过观测不同的配体和磷脂分子的相互作用，结合数理统计，可估算配体和磷脂之间的亲和力，并利用染料的荧光特性予以视觉呈现。
[0021](3)不同于传统均相体系中的静态分析，多相的微流控系统能更精确地反应微观分子之间的相互作用。
附图说明
[0022]图1为微流控芯片及反应室尺寸。
[0023]图2为实验示意图。
[0024]图3为微流控芯片制作过程。
[0025]图4为当配体为钙离子时的通道荧光图像变化。
[0026]图5为不同浓度钙离子下的动力学曲线。
[0027]图6为当配体为钙离子时的Langmuir模型拟合结果(回归系数R2＝0.984)。
[0028]图7为不同浓度镁离子下的动力学曲线。
[0029]图8为当配体为镁离子时的Langmuir模型拟合结果(回归系数R2＝0.977)
[0030]图9为当配体为Tim
‑
3蛋白时，激发波长为473nm的通道荧光图像变化。
[0031]图10为当配体为Tim
‑
3蛋白时，激发波长为535nm的通道荧光图像。
具体实施方式...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于配体浓度梯度驱动磷脂膜化学趋向的亲和分析方法，其特征在于，该方法基于微流控芯片实现，所述微流控芯片用作反应室，包括PDMS器件和盖玻片，二者无缝粘合；所述PDMS器件设有3个液体入口、1个液体出口和1个液体通道；包括以下步骤：(1)配制单层脂质体溶液和含特定配体的缓冲溶液；所述单层脂质体溶液是通过冻融挤出法制备的，具体为：将含有NBD染料的磷脂溶于缓冲溶液中，经多次冻融过程形成大单层脂质体，再经多次脂质体挤出器挤出，最终形成粒径均一的单层脂质体溶液；将特定配体溶于缓冲溶液中，形成含特定配体的缓冲溶液；所述特定配体为钙离子、镁离子或Tim
‑
3蛋白；(2)将步骤(1)中配制好的脂质体溶液从微流控芯片的液体出口处通入，使其充满微流控芯片，孵育30
‑
60min，经破裂融合形成磷脂膜；(3)分别从微流控芯片的三个液体入口以相同的流速通入缓冲溶液，持续20
‑
40min，以冲洗磷脂膜上方剩余的脂质体；(4)将从中间的液体入口通入的缓冲溶液替换为含特定配体的缓冲溶液，且多次替换浓度逐渐升高的含特定配体的缓冲溶液，两侧的缓冲溶液的流速均不变，含特定配体的缓冲溶液的流速与两侧的缓冲溶液的流速保持一...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓盛元，卓西勇，李斌，高可教，吴莹，陈嘉亮，肖明，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：