一种精确区分EPS提取过程中EPS水解和细胞裂解的方法技术

本发明专利技术公开了一种精确区分EPS提取过程中EPS水解和细胞裂解的方法，具体为：采用不同方法提取微生物聚集体的EPS，向处理后的混合液中加入细胞核酸荧光染料进行核酸染色，再采用流式细胞仪检测荧光信号，以未经提取操作处理为对照，对比处理前后荧光信号的差值。本发明专利技术采用流式细胞术结合细胞核酸荧光染料能够灵敏、精确地评价EPS的提取效率和提取造成的细胞破裂程度，适用于探究采用物理、化学和物化联用等方法提取微生物聚集体的EPS的最佳方法和最佳提取条件。和最佳提取条件。和最佳提取条件。

【技术实现步骤摘要】
一种精确区分EPS提取过程中EPS水解和细胞裂解的方法


[0001]本专利技术属于环境生物工程
，具体涉及一种精确区分EPS提取过程中EPS水解和细胞裂解的方法。

技术介绍

[0002]细胞外聚合物(EPS)是在一定环境条件下由微生物分泌于体外的具有多种官能团的高分子聚合物，是生物膜的重要组成部分。生物膜EPS的特殊空间分布和理化性质(如表面电荷、吸附特性、疏水性、脱水性等)决定了其在污水生物处理系统中的重要作用。在氧基质膜生物膜反应器(O2‑
MBfR)中，富含蛋白质的EPS可以在灰水处理过程中快速吸附直链十二烷基苯磺酸钠(LAS)，从而实现生物膜对LAS的快速富集，短期内可降低LAS对微生物胞内酶的毒害作用，并且利于后续的LAS持续高效生物降解。EPS的官能团能够捕获LAS，进而刺激耐药细菌产生抗生素耐药基因(ARG)。高EPS还导致ARG大量积累到O2‑
MBfR的生物膜中。为了定量分析生物膜EPS的动态变化并阐明EPS在O2‑
MBfR处理灰水中的作用，至关重要的一步是从生物膜中提取EPS。有效的EPS提取方法应达到最高的EPS提取效率，且EPS变性和细胞破坏程度最小。
[0003]常用的EPS提取方法包括阳离子交换树脂、热提取、乙醇、酸碱处理和酶提取。与其他方法相比，热提取可以提取更多富含化学基团的EPS；然而，热处理会增加细胞膜的渗透性、引起蛋白质的变性，甚至导致细胞膜破裂从而释放大量的胞内有机物。提取物中的核酸(DNA)浓度通常用作细胞裂解的指标。由于EPS通常含有少量DNA，所有提取方法都可能导致胞外和胞内DNA的释放，因此简单检测DNA浓度并不是区分EPS释放和细胞裂解的精确方法。运用激光共焦扫描显微镜(CLSM)技术来测定微生物活死细胞比例，并用来评估细胞裂解，但显微镜结合细胞染色只能用于评估微生物活性和细胞膜完整性，而不能准确评估胞内有机物的释放。
[0004]由于提取物中核酸浓度检测以及激光共焦扫描显微镜技术均不能精确区分EPS释放和细胞裂解，导致难以获取适用于不同EPS提取的最佳方式和最佳条件，进而影响了EPS的高效高质量提取。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的问题，本专利技术旨在提供一种精确区分EPS提取过程中EPS水解释放和细胞裂解释放胞内有机物的方法，基于此技术，有助于挖掘高效提取EPS的同时保证EPS变性和细胞膜裂解程度最小的EPS提取方法和最佳提取条件。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种精确区分EPS提取过程中EPS水解和细胞裂解的方法，包括以下步骤：
[0008]1)对待提取的微生物聚集体进行预处理，取部分所得样品中并加入细胞核酸荧光染料进行核酸染色，然后采用流式细胞仪检测荧光信号；
[0009]2)对预处理后的样品进行EPS提取操作，向提取反应液中加入细胞核酸荧光染料
进行核酸染色，然后采用流式细胞仪检测荧光信号，该步骤中的染色条件和检测条件均同步骤1)保持一致；
[0010]3)对比步骤1)和步骤2)所得荧光信号的差值。
[0011]在上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法中，所述微生物聚集体可以为生物膜、活性污泥、颗粒污泥以及微藻类等，提取所述微生物聚集体的EPS的提取方法可以为物理提取方法，化学提取方法，物化联用提取方法等。
[0012]在上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法中，所述细胞核酸荧光染料是一种易穿过受损细胞膜而不能透过活细胞膜的核酸染料，其与DNA结合后发出的荧光可被流式细胞仪敏感检测到；本专利技术所述细胞核酸荧光染料优选SYTOX Green(SG)染料。
[0013]上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法的原理为：以SG染料为例，由SG染色的未经提取处理的微生物聚集体中检测到的荧光仅来源于EPS中DNA与SG的复合物；而在提取过程中，提取条件(如高温)和化学试剂(如阳离子交换树脂)等不仅能促进EPS水解，还会提高细胞膜渗透性，甚至导致细胞裂解；由于细胞内DNA浓度大大高于EPS中DNA浓度，提取反应液经SG染料染色后，细胞膜受损的细胞荧光强度应远高于未受损细胞发出的荧光强度。故核酸荧光染色结合流式细胞仪分析可以灵敏、精确区分生物膜EPS提取过程中EPS水解和细胞裂解，进而实现对提取方法和提取条件的评估。
[0014]在上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法中，核酸染色时，SYTOX Green染料的终浓度为(1.0～5.0)
×
10
‑3mM，并于黑暗条件下反应10～20min。
[0015]在上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法中，流式细胞仪的进样速度优选为300～400个颗粒/秒。检测细胞数可以根据实际情况进行设定，可以理解的是，细胞数采集量越大准确率越高，不过当细胞数达到一定数量后，增加细胞采集数对准确率基本无影响。
[0016]在上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法中，步骤1)中对微生物聚集体进行预处理的目的在于去除样品中的可溶性微生物产物或其他可溶性物质。当微生物聚集体为生物膜时，预处理的方法可以为：将生物膜离心去除上清液，再用磷酸盐缓冲液重悬沉淀。
[0017]优选地，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，组成成分具体为：2mM Na3PO4，4mM Na2HPO4，9mM NaCl和1mM KCl。
[0018]在上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法中，步骤2)中的提取操作可以为加热提取，即将预处理后的样品直接置于加热环境下反应，待反应结束后，冷却至室温后再进行染色、检测。
[0019]在上述精确区分EPS水解和细胞裂解的方法中，步骤3)中的提取操作可以为阳离子交换树脂(CER)法提取，具体为：向与处理后的样品中按比例投加CER，然后于搅拌条件下反应。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0021]本专利技术提供了一种新颖的区分EPS提取过程中EPS水解释放和细胞裂解的方法，该方法相较于提取物中核酸浓度检测以及激光共焦扫描显微镜技术，能更为灵敏、精确的评估EPS提取过程中的胞内有机物的释放状况。故该方法可用于评估采用物理、化学和物化联用法来提取包括生物膜、活性污泥、颗粒污泥及微藻等所有微生物聚集体的EPS提取，并为污水生物处理系统中生物膜的形成和定向调控提供指导。
附图说明
[0022]图1为实施例1中不同热处理条件下EPS中蛋白质(A)、多糖(B)和DNA(C)含量的动态变化图；
[0023]图2为实施例1中不同温度下热处理30min时的生物膜样品的流式细胞仪检测结果图；
[0024]图3为实施例1中不同温度下热处理时间与FC中斜率(SL)的线性关系图；
[0025]图4为实施例1中FC荧光光谱图(A)和LHI(≤1100FIU)与HFI(＞1100FIU)发射荧光强度的分布(B)；
[0026]图5为实施例1中不同热处理条件下CLSM结果中生物膜活死本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精确区分EPS提取过程中EPS水解和细胞裂解的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)对待提取的微生物聚集体进行预处理，取部分所得样品并加入细胞核酸荧光染料进行核酸染色，然后采用流式细胞仪检测荧光信号；2)对预处理后的样品进行EPS提取操作，向提取反应液中加入细胞核酸荧光染料进行核酸染色，然后采用流式细胞仪检测荧光信号，所述染色和检测的条件同步骤1)；3)对比步骤1)和步骤2)所得荧光信号的差值。2.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周云，崔晓彩，任恬，王晨辉，任青青，伍贝贝，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：