本发明专利技术涉及一株春雷霉素(Kasugamycin)高产菌株、及其应用和筛选方法，所述菌株为小金色链霉菌(Streptomyces microaureaus)，所述菌株已由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏号为CCTCC M20221737，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，本发明专利技术其解决了现有菌株春雷霉素含量较低的技术问题。本发明专利技术筛选得到的春雷霉素高产的菌株，其发酵液在防治革兰氏阳性和阴性细菌的各种感染尤其是对绿脓杆菌有较高疗效，用于防治水稻稻瘟病等，对人畜无毒，无污染。无污染。
【技术实现步骤摘要】
一种春雷霉素高产菌株、其应用以及筛选方法
[0001]本专利技术属于微生物制药领域，具体涉及一种春雷霉素高产菌株、其应用以及筛选方法。
技术介绍
[0002]春雷霉素(Kasugamycin)在防治革兰氏阳性和阴性细菌的各种感染尤其是对绿脓杆菌有较高疗效，用于防治水稻稻瘟病等，对人畜无毒，无污染。作用机理为通过作用于30s核糖体亚基而阻碍蛋白质的合成。其产生菌是小金色链霉菌(Streptomyces microaureaus)为革兰氏阳性细菌，严格好氧，形成气生菌丝和基内菌丝，菌苔呈粉白至浅灰色。
[0003]在微生物菌种选育过程中，诱变育种是主要方法之一。它利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其在非自然条件下随机突变频率大幅度提高，然后用简便快速高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株(如高产株或有效组分比例高的菌株)。其中物理诱变即利用物理因素(如紫外线、X射线、γ射线、快中子等)对悬液进行一定剂量一定时间的照射，使细胞内的遗传物质(如DNA)复制系统出错，从而诱发变异。化学诱变—利用化学诱变剂[如亚硝酸、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、N
‑
甲基
‑
N
’‑
硝基
‑
N
‑
亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲、氮芥、乙烯亚胺、羟胺、氯化锂、秋水胆碱等]对悬液进行一定浓度一定时间的作用处理，使细胞内的遗传物质(如DNA)复制系统出错，从而诱发变异。
技术实现思路
[0004]为了解决现有技术中春雷霉素含量较低的问题，本专利技术提供一种春雷霉素高产菌株、及其应用和筛选方法。
[0005]本专利技术一方面涉及一种春雷霉素高产菌株，所述菌株为小金色链霉菌MKL
‑
2(Streptomyces microaureaus MKL
‑
2)，所述菌株已由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏号为CCTCC M20221737，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
[0006]本专利技术另一方面还涉及上述春雷霉素高产菌株在产春雷霉素中的应用。
[0007]优选的，所述春雷霉素高产菌株在发酵培养基中培养，所述发酵培养基的配方为：低温黄豆饼粉50
‑
60g/L、玉米淀粉20
‑
30g/L、α淀粉酶为玉米淀粉的0.01
‑
0.02％、KH2PO40.5
‑
2.0g/L、NaCl 1
‑
3g/L、玉米油8
‑
12g/L，自来水配制，所述摇瓶发酵培养基的pH值为消前6.0
‑
6.8。
[0008]优选的，所述春雷霉素高产菌株在发酵培养基中培养之后，发酵培养基中春雷霉素为3.2g/L以上；优选为3.5g/L以上。
[0009]本专利技术另一方面还涉及上述春雷霉素高产菌株的筛选方法，其主要步骤如下：
[0010]步骤1将春雷霉素出发菌株小金色链霉菌(Streptomyces microaureaus)接种于斜面培养基恒温培养；
[0011]步骤2挑选步骤1培养好的孢子，加入生理盐水，梯度稀释，涂布于培养基平板上，
恒温培养后长出单菌落；
[0012]步骤3挑选步骤2饱满合格的单菌落，均匀切开，其中一半用于制作诱变的孢子悬液，另外一半用于摇瓶考核对照；
[0013]步骤4将步骤3切下的半个单菌落加入含20％甘油的生理盐水，振荡分散制成待诱变孢子悬液；
[0014]步骤5吸取步骤4制成的待诱变孢子悬液15μL滴入ARTP诱变育种仪的载片上，均匀涂开；
[0015]步骤6将步骤5所述的滴加到载片的悬液先紫外诱变，再日光灯照射，然后ARTP诱变，得到诱变液；
[0016]步骤7用无菌生理盐水洗下步骤6所述的诱变液；
[0017]步骤8保持黑暗或在红光下，将步骤7所述的诱变液用生理盐水梯度稀释，分别涂布于培养基平板上，恒温培养；
[0018]步骤9挑选步骤8培养突变的单菌落，切下其中一半单菌落接种到摇瓶种子培养基，恒温振荡培养。将步骤3剩余的半个单菌落也接种到摇瓶种子培养基，恒温振荡培养。另外半个单菌落均要保留；
[0019]步骤10将步骤9培养的摇瓶种子以1—10％的接种量接种到摇瓶发酵培养基中继续恒温振荡培养；
[0020]步骤11对步骤10的各发酵瓶发酵液中春雷霉素含量进行检测，与出发菌株单菌落比较代谢春雷霉素含量，筛选比出发菌株提高的菌株MKL
‑
2，已在CCTCC保藏(编号为CCTCC M20221737)。
[0021]优选的，所述步骤1、2、8中的斜面培养基包括以下成份：甘油1.0％、胰蛋白胨0.3％、高温黄豆饼粉1.0％、NaCl 0.25％、CaCO
3 0.2％、琼脂2.0％，其余是蒸馏水，所述斜面培养基的消前pH7.0。
[0022]优选的，所述步骤9中，摇瓶种子培养基包括以下成份：低温黄豆饼粉1.5％、牛肉膏1.0％、果葡糖浆0.2％、KH2PO
4 0.1％、NaCl 0.3％、玉米油1.0％，自来水配制，消前pH自然。
[0023]优选的，所述步骤10中，摇瓶发酵培养基包括以下成份：低温黄豆饼粉5.5％、玉米淀粉2.5％、α淀粉酶为淀粉的0.015％、KH2PO
4 0.1％、NaCl 0.2％、玉米油1.0％，自来水配制，所述摇瓶发酵培养基的pH值为消前6.4。
[0024]优选的，所述步骤6中诱变参数为
①
紫外：15W紫光灯距离悬液30cm，照射5—60秒；
②
日光照射：日光灯照射3分钟；
③
ARTP：照射功率120W，氦气流量8—12SLM，照射10—180秒。
[0025]优选的，所述步骤1、2的培养参数为温度28℃培养6天。
[0026]优选的，所述步骤8的培养为温度28℃暗处培养9天。
[0027]优选的，所述步骤9所述的培养为在28℃、转速220rpm恒温摇床培养43小时。
[0028]优选的，所述步骤10的培养为在28℃、转速220rpm恒温摇床培养130—140小时。
[0029]本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种春雷霉素高产菌株、及其应用，本专利技术筛选得到春雷霉素高产菌株的发酵液主要成分为春雷霉素，其发酵液对水稻稻瘟病、猕猴桃溃疡病、细菌性角斑病和黄瓜炭疽病等具有抑菌作用。本专利技术的筛选方法可以理性快速地
筛选高产菌株，简单易行，所涉及的培养基原料成本低、来源广，具有十分重要的工农业应用潜力。
附图说明
[0030]图1为出发菌株121#发酵液HPLC分析图谱。
[0031]图2为春雷霉素高产菌株MKL
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2发酵液HPLC分析图谱。
具体实施方式
[0032]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种春雷霉素高产菌株，所述菌株为小金色链霉菌MKL
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2(Streptomyces microaureaus MKL
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2)，所述菌株已由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏号为CCTCC M20221737，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。2.权利要求1所述的春雷霉素高产菌株在产春雷霉素中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述春雷霉素高产菌株在发酵培养基中培养，所述发酵培养基的配方为：低温黄豆饼粉50
‑
60g/L、玉米淀粉20
‑
30g/L、α淀粉酶为玉米淀粉的0.01
‑
0.02％、KH2PO
4 0.5
‑
2.0g/L、NaCl 1
‑
3g/L、玉米油8
‑
12g/L，自来水配制，所述摇瓶发酵培养基的pH值为消前6.0
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6.8。4.根据全要求3所述的应用，所述春雷霉素高产菌株在发酵培养基中培养之后，发酵培养基中春雷霉素为3.2g/L以上；优选为3.5g/L以上。5.一种春雷霉素高产菌株的筛选方法，其特征是包括以下步骤：步骤1将春雷霉素出发菌株小金色链霉菌(Streptomyces microaureaus)接种于斜面培养基恒温培养；步骤2挑选步骤1培养好的孢子，加入生理盐水，梯度稀释，涂布于培养基平板上，恒温培养后长出单菌落；步骤3挑选步骤2饱满合格的单菌落，均匀切开，其中一半用于制作诱变的孢子悬液，另外一半用于摇瓶考核对照；步骤4将步骤3切下的半个单菌落加入含20％甘油的生理盐水，振荡分散制成待诱变孢子悬液；步骤5吸取步骤4制成的待诱变孢子悬液15μL滴入ARTP诱变育种仪的载片上，均匀涂开；步骤6将步骤5所述的滴加到载片的悬液先紫外诱变，再日光灯照射，然后ARTP诱变，得到诱变液；步骤7用无菌生理盐水洗下步骤6所述的诱变液；步骤8保持黑暗或在红光下，将步骤7所述的诱变液用生理盐水梯度稀释，分别涂布于培养基平板上，恒温培养；步骤9挑选步骤8培养突变的单菌落，切下其中一半...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨玉旺，仵林娟，潘忠成，师维，郭秀艳，邓钊，
申请(专利权)人：陕西麦可罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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