催化β-香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了催化β

【技术实现步骤摘要】
催化
β
‑
香树脂醇16
α
位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别地涉及催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用。

技术介绍

[0002]娑罗子是《中国药典》收录的一味重要中药，七叶皂苷是其主要活性成分，具有消炎、消肿、抗肿瘤以及抗病毒等多种药理活性，在临床上常用于治疗慢性静脉功能不全、静脉栓塞、痔疮和术后水肿等。虽然七叶皂苷具有重要的医用价值，但有关其生物合成途径解析研究相对薄弱，迫切需要利用新技术新方法解析七叶皂苷生物合成途径。
[0003]三萜属于异戊二烯类化合物，其合成前体法尼基焦磷酸主要来源于甲羟戊酸途径(Mevalonate Pathway,MVA)，法尼基焦磷酸依次经过鲨烯合酶、角鲨烯单加氧酶催化作用形成2,3
‑
氧化鲨烯，2,3
‑
氧化鲨烯是三萜和固醇类化合物生物合成的共同前体物质，其在2,3
‑
氧化鲨烯环化酶的催化作用下形成不同的三萜骨架，其中β
‑
香树脂醇是最常见的三萜骨架。CYP450酶可催化β
‑
香树脂醇的氧化，大量研究表明CYP716家族的酶可催化五环三萜骨架的C
‑
28、C
‑
16、C
‑
22或C
‑
12位羟基化等其他形式氧化。上述研究结果表明CYP716家族对五环三萜的羟基化修饰具有重要作用，且不同的CYP716具有不同的底物特异性和不同的催化活性。
[0004]由于七叶皂苷具有良好的抗炎、消肿、抗病毒等药理活性，在临床上供不应求，导致七叶皂苷资源供应紧张，因此迫切需要利用新技术新方法解决七叶皂苷的资源供应紧张问题。

技术实现思路

[0005]对植物CYP450基因的发现和鉴定，在三萜生物合成的探索中起着至关重要的作用。CYP450催化β
‑
香树脂醇羟基化可为进一步的糖基化、酰基化提供位点，形成结构多样的三萜化合物，为三萜类药物开发提供丰富的先导化合物。解析催化β
‑
香树脂醇C
‑
16α位羟基化的CYP450基因不仅为七叶皂苷的合成生物学研究提供关键基因模块，同时为七叶树的新品种培育提供关键位点，而且为研究五环三萜化合物的羟基化修饰提供重要参考。
[0006]有鉴于此，本专利技术的主要目的是提供催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：
[0009]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010]b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化的酶活性的由a)衍生的蛋白质。
[0011]所述催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化是催化β
‑
香树脂醇生成16α
‑
羟基
‑
β
‑
香树脂醇。
[0012]所述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。
[0013]所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：
[0014]1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；
[0015]2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；
[0016]3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。
[0017]将该基因命名为AcCYP716A275，将其编码的蛋白命名为AcCYP716A275。具体信息如下：AcCYP716A275基因序列如序列表中序列1所示，其含有1407个核苷酸，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由468个氨基酸组成。
[0018]含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物也属于本专利技术的保护范围。
[0019]所述蛋白在作为催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化的关键酶中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0020]所述催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化是催化β
‑
香树脂醇生成16α
‑
羟基
‑
β
‑
香树脂醇。
[0021]所述蛋白、所述编码基因在催化β
‑
香树脂醇生成16α
‑
羟基
‑
β
‑
香树脂醇中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0022]本专利技术基于七叶树叶、枝、花、外果皮、种仁不同组织部位的高通量测序，挖掘出催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化的关键酶，不仅为七叶皂苷的合成生物学研究提供关键基因模块，而且为七叶树的分子设计育种提供关键基因位点。
[0023]本专利技术综合利用转录组数据分析，挖掘到催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化的CYP450基因，并利用烟草瞬时表达系统验证了AcCYP716A275可催化16α
‑
羟基
‑
β
‑
香树脂醇的形成，不仅为七叶皂苷A的生物合成提供重要基因元件，16α
‑
羟基
‑
β香树脂醇和七叶皂苷A的结构式如图1所示，同时本专利技术研究结果可为七叶树的分子设计育种提供关键基因位点。
附图说明
[0024]为了说明而非限制的目的，现在将根据本专利技术的优选实施例、特别是参考附图来描述本专利技术，其中：
[0025]图1为16α
‑
羟基
‑
β香树脂醇及七叶皂苷A分子结构式。
[0026]图2为AcCYP716A275基因在七叶树不同组织中的表达量(注：字母代表方差分析邓肯新复极差检验在p<0.05显著性水平下的差异显著)。
[0027]图3为pEAQ
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HT
‑
DEST
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BfCYP716Y1载体示意图。
[0028]图4为AcCYP716A275基因克隆和载体构建PCR胶图。
[0029]图5为pEAQ
‑
HT
‑
DEST
‑
AcCYP716A275载体示意图。
[0030]图6为目的基因农杆菌菌液PCR胶图。
[0031]图7为注射烟草产物鉴定GC
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MS图。
具体实施方式
[0032]实施例1、克隆催化β
‑
香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白的编码基因一、基因克隆的方法和步骤
[0033]七叶皂苷A主要在七叶树种仁中富本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有催化β
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香树脂醇16α位羟基化的酶活性的由a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述催化β
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香树脂醇16α位羟基化是催化β
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香树脂醇生成16α
‑
羟基
‑
β
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香树脂醇。3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；3...

【专利技术属性】
技术研发人员：万会花，孙伟，陈士林，徐志超，解雪华，孟祥霄，陈伟强，曹雪，王思凡，米要磊，尹青岗，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：