植物代谢介导诱导土壤细菌生物膜形成以增加生物固氮和植物氮同化制造技术

本发明专利技术提供了在减少的无机氮条件下生长的粮食作物的增产方法。的粮食作物的增产方法。的粮食作物的增产方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】植物代谢介导诱导土壤细菌生物膜形成以增加生物固氮和植物氮同化
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2020年7月13日提交的美国临时申请第63/051,267号的优先权，其通过引用全文纳入本文。

技术介绍

[0002]在土壤中，植物不断暴露在富含微生物的环境中，这可能对植物生长有利或有害。当可能兼容的细菌伴侣感知植物(宿主)信号时，会建立广泛的多阶段化学通信，以产生成功的植物
‑
微生物相互作用(1，2)。相比之下，植物具有对抗病原体感染的独特防御机制，宿主植物和病原体之间的竞争(arm race)迅速推动了植物抗性基因和病原体无毒效应物的共同进化(3，4)。植物对此类环境的适应包括通过根系分泌物的作用塑造其微生物群(5)。据估计，植物会排出其固定氮的20％，以换取磷和氮的获取、抵御生物和非生物胁迫等好处(6，7)。
[0003]植物和细菌共生的最佳特征示例是豆科植物和固氮根瘤菌的结合，以及根瘤的特征形成。根瘤是固氮的主要器官，其形成需要共同的共生途径(1，2)。在土壤中，根瘤菌感知宿主的化学信号(例如类黄酮)，并通过nodD
‑
类黄酮相互作用进一步活化nod基因的表达。Nod基因编码的脂壳寡糖(LCO)可以被位于豆科植物根质膜上的LysM受体激酶识别，并且可以在细胞核中触发钙尖峰。钙信号通过Ca
2+
/CaM
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依赖性蛋白激酶(CCaMK)和转录因子CYCLOPS的磷酸化来解码。然后，一组其他转录因子被激活，用于调节宿主根毛的卷曲和感染线的生长，导致根瘤形成(2，8)。
[0004]豆科根瘤菌共生具有非常严格的特异性，因此每种豆科植物只能与一组特定的根瘤菌相互作用，反之亦然(9)。这种狭窄宿主范围限制了根瘤菌在其他重要的非豆科作物如水稻、小麦或玉米上的应用。另一方面，非豆科作物可能与其他植物生长促进细菌(PGPB)形成互惠关系，并从它们的伴侣处获得氮需求。通过
15
N富集实验估算的空气氮(Ndfa)表明，生物固氮(BNF)可占水稻总氮需求的1.5～21.0％，具体取决于基因型(10)。有趣的是，这类相互作用似乎不需要共同的共生途径，至少对于Azoarcus sp.(固氮弯曲菌)与水稻的相互作用来说是如此(11)。这种互惠关系是如何建立或调节的，仍有待调查。
[0005]生物膜对于宿主植物的最佳定植至关重要，并有助于固氮。生物膜通常由包埋在含有多糖、蛋白质、脂质和胞外DNA(12)细胞外聚合物质(EPS)的自产基质中的“聚集物”接种。基质为细菌提供保护和营养，并有助于对抗菌化合物的耐受性/耐药性。此外，生物膜通过化学通信(群体感应)实现有效的相互作用，以动态重塑土壤细菌群落，使生物膜成为地球上最成功的生命模式之一(13)。在某些情况下，生物膜的形成对于成功的细菌定植是必不可少的。例如，固重氮葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)突变体MGD在多糖生产方面存在缺陷，不能形成生物膜(不产生EPS)，不能附着在植物根表面，也不能在根上内生定植(14)。
[0006]生物膜EPS基质的形成也会产生异质性，包括建立稳定的营养梯度、pH值和氧化还
原条件。更重要的是，由于氧在细菌生物膜上的扩散减少，自由生活的固氮细菌(巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilen)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)等)能够在自然好氧条件下固定氮(15)，因为细菌固氮酶因细菌表面氧浓度低而受到保护，不会受到氧诱导的损害。
[0007]类黄酮是一组与细胞信号转导通路、微生物反应相关的代谢产物，通常与植物对氧化剂的反应相关。类黄酮由短碳链(3
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4个碳)连接的苯环组成。类黄酮包括六种主要亚型，包括查耳酮、黄酮、异类黄酮、黄烷酮、花黄素和花青素(通常导致某些植物器官的红色/紫色)。
[0008]需要新的方法来开发具有更强的固定大气氮能力的作物植物，例如，允许它们在减少的无机氮条件下生长。本专利技术满足该需求，并且还提供了其它优点。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了提高植物同化大气氮的能力的方法和组合物，特别是通过改变植物以使其产生增加水平的黄酮。黄酮可以从植物根部渗出，导致土壤中细菌生物膜的形成和固氮作用增加。
[0010]在一个方面，本专利技术提供了一种提高作物植物同化大气氮的能力的方法，该方法包括修饰植物的一个或多个细胞中参与黄酮生物合成或降解的基因的表达，使得植物产生增加量的一种或多种黄酮，其中所述一种或多种黄酮从植物的根部排出。
[0011]在该方法的一些实施方式中，一种或多种黄酮诱导存在于植物根部附近土壤中的固氮细菌形成生物膜。在一些实施方式中，生物膜的形成导致细菌固定大气氮的能力增加，并且其中固定的大气氮被植物同化。在一些实施方式中，一种或多种黄酮中的至少一种被糖基化。在一些实施方式中，一种或多种黄酮包括芹菜素、芹菜素
‑7‑
葡糖苷或木犀草素。
[0012]在一些实施方式中，通过编辑基因的内源性拷贝来改变植物的一个或多个细胞中基因的表达。在一些这样的实施方式中，通过将靶向基因的向导RNA和RNA
‑
引导的核酸酶引入植物的一个或多个细胞来修饰基因的内源性拷贝。在一些实施方式中，该方法还包括将供体模板引入所述一个或多个细胞，所述供体模板包含与围绕所述向导RNA的靶位点的基因组区域同源的序列，其中所述RNA
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引导的核酸酶在靶位点处切割DNA，并且用供体模板修复DNA。在一些实施方式中，RNA
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引导的核酸酶是Cas9或Cpf1。
[0013]在一些实施方式中，修饰基因的内源性拷贝以减少或消除其表达。在一些这样的实施方式中，基因的内源性拷贝缺失。在一些实施方式中，该基因是CYP 75B3或CYP 75B4，或其同源物或直系同源物。在一些实施方式中，基因包含与SEQ ID NO:2、4、6或8中的任一基本相同(具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性)的核苷酸序列，或编码多肽，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或14
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120中的任一基本相同(具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性)的氨基酸序列。
[0014]在一些实施方式中，向导RNA包含与SEQ ID NO:11
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13中的任何一个基本相同(例如，包含0、1、2或3个错配)的靶序列。在一些实施方式中，向导RNA包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中的序列基本相同(例如，包含0、1、2或3个错配)的靶序列。
[0015]在一些实施方式中，修饰基因的内源性拷贝以增加其表达。在一些这样的实施方
式中，通过用异源启动子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种提高作物植物同化大气氮的能力的方法，该方法包括修饰植物的一个或多个细胞中参与黄酮生物合成或降解的基因的表达，使得植物产生增加量的一种或多种黄酮，其中所述一种或多种黄酮从植物的根部排出。2.如权利要求1所述的方法，其中一种或多种黄酮诱导存在于植物根部附近土壤中的N2固定细菌形成生物膜。3.如权利要求1或2所述的方法，其中生物膜的形成导致细菌固定大气氮的能力增加，并且其中固定的大气氮被植物同化。4.如权利要求1
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3任一所述的方法，其中一种或多种黄酮中的至少一种被糖基化。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种黄酮包括芹菜素、芹菜素
‑7‑
葡糖苷或木犀草素。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过编辑所述基因的内源性拷贝来改变所述基因在所述植物的一个或多个细胞中的表达。7.如权利要求6所述的方法，其中通过将靶向所述基因的向导RNA和RNA
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引导的核酸酶引入植物的一个或多个细胞来修饰基因的内源性拷贝。8.如权利要求7所述的方法，还包括将供体模板引入所述一个或多个细胞，所述供体模板包含与围绕所述向导RNA的靶位点的基因组区域同源的序列，其中所述RNA
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引导的核酸酶在靶位点处切割DNA，并且用供体模板修复DNA。9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述RNA引导的核酸酶是Cas9或Cpf1。10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述基因的内源性拷贝被修饰以减少或消除其表达。11.如权利要求10所述的方法，其中所述基因的内源性拷贝缺失。12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述基因是CYP75B3或CYP75B4，或其同源物或直向同源物。13.如权利要求12所述的方法，其中基因包含与SEQ ID NO:2、4、6或8中的任一基本相同(具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性)的核苷酸序列，或编码多肽，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或14
‑
120中的任一基本相同(具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性)的氨基酸序列。14.如权利要求7
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13任一所述的方法，其中向导RNA包含与SEQ IDNO:11
‑
13中的任何一个基本相同(例如，包含0、1、2或3个错配)的靶序列。15.如权利要求7
‑
13任一所述的方法，其中向导RNA包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中的序列基本相同(例如包含0、1、2或3个错配)的靶序列。16.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述基因的内源性拷贝被修饰以增加其表达。17.如权利要求16所述的方法，其中通过用异源启动子替换内源性启动子来修饰所述基因的内源性拷贝。18.如权利要求17所述的方法，其中所述异源启动子是诱导型启动子。19.如权利要求17所述的方法，其中所述异源启动子是组成型启动子。20.如权利要求17所述的方法，其中所述异源启动子是组织或器官特异性启动子。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述器官是根和/或所述组织是根组织。22.如权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述基因是CYP 93G1或其同源物或直向同源物。23.如权利要求22所述的方法，其中基因编码包含与SEQ ID NO:121
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【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：