一种莱茵衣藻耐铬突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种莱茵衣藻耐铬突变体，保藏编号为CCTCC M 2023086,于2023年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心。同时，本发明专利技术还公开所述莱茵衣藻耐铬突变体在去除水体中铬离子中的应用。本发明专利技术通过电转化的方法筛选出耐铬的突变体，能在较高浓度的六价铬下生长，同时富集更多的六价铬，对六价铬的吸收和耐受都表现出优异的性能。表现出优异的性能。表现出优异的性能。

【技术实现步骤摘要】
一种莱茵衣藻耐铬突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物废水处理
，具体涉及一种莱茵衣藻耐铬突变体及其应用。

技术介绍

[0002]目前用于污水中重金属的生物种类众多，包括水生植物、细菌和酵母等。微藻是其中一种广泛存在于自然水体的微生物，其生长速度快，分布广泛，同时微藻细胞壁的成分有羧基、羟基、巯基等官能团，对六价铬具有高效的吸附作用。并且其胞内的溶酶体样细胞器对Cr(VI)有富集作用。然而，自然界中的微藻对六价铬的耐受能力差，往往抑制藻类生长，导致藻类容易死亡，降低了对六价铬的富集效率。

技术实现思路

[0003]针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种莱茵衣藻耐铬突变体及其应用，对铬的耐受性强，可以在较高浓度的Cr(VI)下生长，从而富集更多的六价铬。
[0004] 一种莱茵衣藻耐铬突变体，保藏编号为CCTCC M 2023086,于2023年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心。
[0005] 所述莱茵衣藻耐铬突变体是通过以下方法制备得到：将质粒pMJ013b中的FSD::AphVIII::RSD片段随机插入莱茵衣藻中，然后通过电转化，筛选得到；其中，所述质粒pMJ013b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述FSD::AphVIII::RSD片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0006]本专利技术所述的莱茵衣藻耐铬突变体在去除水体中铬离子中的应用。
[0007]优选地，所述应用为莱茵衣藻耐铬突变体在制备富集铬离子的试剂或固定化材料中的应用。
[0008] 本专利技术通过正向遗传学的手段在莱茵衣藻HS592基因组DNA中随机插入FSD::AphVIII::RSD的片段，然后通过电转化的方法，筛选出了耐受高浓度铬的衣藻突变体，得到的衣藻突变体在含50μM K2Cr2O7的TAP培养基中培养6d，对培养基中铬的去除效率高，能达到21.75%。
[0009]本专利技术所述莱茵衣藻耐铬突变体的保藏信息如下：保藏编号：CCTCC M 2023086；保藏时间：2023年2月2日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；分类命名：衣藻属（Chlamydomonas reinhardtii）。
[0010]本专利技术的优点：本专利技术利用正向遗传学手段，通过电转化的方法筛选出耐铬的突变体，能在较高浓度的六价铬下生长，同时富集更多的六价铬，对六价铬的吸收和耐受都都表现出优异的
性能。
附图说明
[0011]图1为线性化pHK975质粒；图2为D66电转化及划线；图3为Westernblot筛选；图4为衣藻耐铬突变体的筛选过程流程图；图5为制备FSD::AphVIII::RSD片段；图6为HS592电转化及划线；图7为高浓度重铬酸钾筛选耐Cr突变体；图8为耐铬突变体的生长情况及对Cr的去除率。
实施方式
[0012] 一.本专利技术使用的TAP培养基配方：表1TAP培养基配方
[0013]其中，*将22gTris溶解于100mL水中；**详细信息见下表：表2100
×
TAPsalts配方
[0014]表3Phosphatesalts配方
[0015]表4Tracemetals配方
[0016]混合除EDTA外的所有溶液，并将混合物煮沸，加入EDTA溶液，混合物成绿色，当所有物质溶解后，冷却到70℃，用20% KOH 调节PH至6.7，定容至1L，溶液为清澈的绿色，用棉花塞子将烧瓶塞住，静置1
‑
2周，每天摇晃一次，溶液最终变为紫色，并留下铁锈棕色的沉淀，通过两层Whatman滤纸过滤除去，至溶液变清澈。
[0017] 二. 本专利技术中使用的20%淀粉乙醇溶液的配制（1）20%淀粉准备：（1.1）50mL离心管中称取4g淀粉，30ml无水乙醇洗一遍，离心1000rpm，2min，倒掉上清；（1.2）30mL灭菌蒸馏水洗两次，离心1000rpm，2min，倒掉上清；（1.3）70%乙醇重悬定体积到20mL，得到20%淀粉乙醇溶液，室温放置保存。
[0018] 三、本专利技术中采用的HS592是由野生型莱茵衣藻D66过表达硫酸盐转运蛋白SULTR2获得，具体如下：1. 构建具有SULTR2::2
×
HA基因的质粒pHK975质粒pHK975的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019] 2. 通过电转化转入D66基因组DNA(1) 限制性酶切使用Thermo Scientific的Fermentas 快速限制性内切酶Sca I对质粒pHK975进行酶切。限制性内切酶酶切体系见表5，将酶切体系加入1.5 mL EP管后置于37℃水浴锅反应45 min。
[0020]表5限制性内切酶酶切体系(2)跑胶及胶回收2.1配置 1.5%的琼脂糖EB凝胶，将上述酶切后的体系点样至所述琼脂糖EB凝胶中电泳，在紫外灯的照射下将所需的线性化的pHK975片段切下来，大小为10223bp，见图1，图1中M为DNA Marker，1为pHK975线性化产物；2.2称取空的 1.5 mL 的 EP 管重量，将上述得到的带有 DNA 目的条带的凝胶置于该 EP 管，称取其总重量，计算出凝胶块的质量，按照每1g的凝胶对应1mL的Binding Buffer的量，加入相应体积的Binding Buffer，60℃水浴至凝胶完全溶解，得到DNA
‑
琼脂糖
溶液；2.3 把 HiBind DNA 柱子套在2mL的收集管，转移 DNA
‑
琼脂糖溶液到一个 HiBind DNA 柱子，10000 g/min离心1 min；2.4弃废液，把柱子装入收集管中，转移 700 μL 的溶液至 HiBind DNA 柱子，若混合液超过 700 μL，则分批次转移，然后重复步骤2.3；2.5 把 HiBind DNA 柱子重新装回收集管，加入300μL 的 Binding Buffer，10000 g/min离心1 min；2.6弃去收集管的液体，把柱子装入收集管中；加入700 μLSPW Wash buffer，10000 g/min离心1 min；2.7倒去滤液，将柱子重新装回收集管，13000 g/min离心1 min，以甩干柱子滤膜上残余液体，室温开盖静置 5 min 以挥发乙醇；2.8 把柱子套在一个干净的1.5 mL的离心管上，加入30 μL的65℃预热的灭菌水在柱子膜上，室温静置 2 min，大于13000 g/min离心2 min洗脱出DNA；再洗脱一次以洗脱出来残余的DNA，将得到的DNA 片段保存至
‑
20℃。
[0021] (3)衣藻的电转化3.1 准备细胞：将藻细胞在摇床上以120 r/min，25μE
·
m
‑2·
s
‑1光强，22℃条件下进行培养至2
‑6×
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种莱茵衣藻耐铬突变体，保藏编号为CCTCC M 2023086,于2023年2月2日保藏于中国典型培养物保藏中心。2.根据权利要求1所述莱茵衣藻耐铬突变体，是通过以下方法制备得到的：将质粒pMJ013b中的FSD::AphVIII::RSD片段随机插入莱茵衣藻中，然后通过电转化，筛选得到；其中，所述质粒pMJ013b的核苷酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐雨欣，汪恂，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：