生成多样化病毒文库制造技术

本发明专利技术涉及一种用于产生病毒文库的方法，其包含第一培养步骤和第二培养步骤。这些步骤旨在分别促进同一病毒科的双链DNA病毒之间的种内重组和种间重组。种内重组和种间重组。种内重组和种间重组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生成多样化病毒文库
[0001]本专利技术涉及一种用于产生病毒文库的方法，其包含第一培养步骤和第二培养步骤。这些步骤旨在分别促进同一病毒科的双链DNA病毒之间的种内重组和种间重组。
[0002]病毒在广泛的应用中拥有巨大的潜力，例如溶瘤病毒、疫苗、抗病毒药物和基因治疗载体。迄今为止，大多数产生具有所需性质的病毒的方法都依靠对特定病毒基因组复杂性的逐步了解。然后设计对病毒基因组序列的修饰以将所需特征引入基因组，希望这将使该病毒适合于特定应用。
[0003]需要一种新的方法来加速具有多样化特性的病毒的生成过程，以提供具有高度多样性的文库，从中可以选择针对特定应用而言具有最期望特性的最佳病毒。
[0004]使用多样化病毒文库的一个实例是开发新的溶瘤载体。由于肿瘤能够对治疗产生抗性，因此在开发癌症治疗方法方面一直存在着重大挑战。目前的疗法，包括化疗和放疗，会产生毒性副作用，并且通常功效有限。为了克服这些问题，已经使用溶瘤病毒作为一种新的方法。天然存在的或遗传修饰的溶瘤病毒能够在肿瘤内选择性复制，通过细胞裂解感染和杀死癌细胞而不影响正常细胞，以及根据肿瘤抗原的释放引发抗肿瘤免疫应答。为了确保溶瘤病毒不在正常细胞中复制，选择非致病性病毒株，或通过插入或缺失基因来对病毒基因组进行遗传工程。基因工程溶瘤病毒的实例包括T
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Vec，一种缺失γ34.5和α47基因的疱疹病毒，其被FDA批准用于黑素瘤。然而，迄今为止，基因工程溶瘤病毒在临床上的成功有限。
[0005]尽管存在大于60种血清型的野生型人腺病毒(Ad)，但Ad5及其变体是用作溶瘤腺病毒的显性Ad型。绝大多数其它血清型尚未被开发用作溶瘤病毒。
[0006]产生更多溶瘤病毒的一种方法是使用病毒池进行生物选择或“定向进化”，以生成新的溶瘤病毒血清型。这涉及通过汇集不同的病毒血清型和/或随机引入突变来模拟病毒的天然选择(例如描述于Bauzon和Hermiston,“溶瘤病毒：定向进化的动力(Oncolytic viruses:The Power of Directed Evolution)”；《病毒学进展(Advances in Virology)》,2012卷,文章ID 586389)。Kuhn等人展示了使用定向进化来生成一种新型非Ad5溶瘤病毒用于治疗结肠癌(“定向进化生成用于治疗结肠癌的新型溶瘤病毒(Directed Evolution generates a novel oncolytic virus for the treatment of colon cancer)”；《公共科学图书馆
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综合(PLoS One)》3(6):e2409(2008)；以及WO2008/080003)和卵巢癌(“OvAd1，一种通过三维定向进化为卵巢癌开发的新型强效选择性嵌合溶瘤病毒(OvAd1,a Novel,Potent,and Selective Chimeric Oncolytic Virus Developed for Ovarian Cancer by 3D
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Directed Evolution)”《分子治疗溶瘤剂(Mol.Ther.Oncolytics)》；4:55
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66)。Kuhn和Hermiston等人，汇集具有或不具有嵌合病毒ColoAd1的不同Ad亚组(Ad3、Ad4、Ad5,Ad9,Ad11p,Ad16,Ad35,Ad40)。将随机突变引入病毒池的子样品中，然后加入到未突变的病毒颗粒池。组合的病毒池在人肿瘤细胞系上传代，以引起重组来增加多样性。这导致生成了ColoAd1(Ad3/Ad11p)和OvAd1(Ad3/ColoAd1)嵌合肿瘤病毒，与Ad5相比，它们效力提高，治疗窗口更大。“定向进化”造成ColoAd1的基因组被修饰，包括E3和E4区域缺失、E2B区域改变和定位于病毒的E4orf4区域缺失。嵌合病毒的效力增加可以通过病毒基因组的改变来解
释。在WO2008/080003中描述的另一个实例中，描述了一种使用亚硝酸引入点突变以获得每个病毒基因组约10个突变，随后重组病毒池的方法。
[0007]仍然需要改进方法来提高病毒池的多样性，为筛选/生物选择改进的细胞特异性肿瘤病毒提供起点。
[0008]在Kuhn等人(2008,同上)中，将来自Ad组B的3种血清型和来自Ad组C、D、E和F各自的1种血清型汇集在一起，并在据称引起血清型之间重组的条件下在靶肿瘤细胞系的培养物上进行传代。得到ColoAd1，一种复合Ad3/Ad11p嵌合病毒。Ad3和Ad11p都是Ad组B血清型，因此ColoAd1中的重组是由组内(AdB)重组产生的，即不涉及来自Ad组C、D、E和F的病毒。
[0009]在Kuhn等人的后续论文中。(《分子治疗：溶瘤剂(Molecular Therapy:Oncolytics)》,第4卷,2017年3月,第55
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66页)，产生了另一种嵌合Ad病毒，OvAd1。这是Ad3、Ad11和ColoAd1之间重组的结果，它们都是AdB血清型或嵌合体。
[0010]然而，本专利技术人现在已经认识到，不同的腺病毒物种在不同的细胞系上以不同的速率生长，并且不同的细胞系对病毒重组具有不同的倾向性。因此，可能无法通过使用单个细胞系在单一步骤中促进一组混合的腺病毒物种得到最佳的重组多样性。
[0011]此外，来自不同物种的病毒不太可能相互发起重组事件，因此不太可能参与多样化。然而，将来自任何给定病毒物种的一种以上血清型的病毒在一起培养，可能会导致血清型之间的重组，这可能会产生足够的新的同源性区域，以允许物种之间的重组。
[0012]因此，为了使文库多样性最大化，本专利技术的方法提供了将来自第一物种的至少两种血清型的病毒在一个或多个合适的细胞系上一起培养，以促进种内重组；并且然后仅将来自第一物种的(重组)病毒与来自第二(不同的)物种的一种或多种病毒一起培养，以便促进不同的物种内重组事件和物种间重组。特别有利的是将来自第二物种的至少两种病毒血清型一起培养或提前一起培养，以促进第二物种内的物种内重组。在该过程期间或之后，可对所得重组病毒进行进一步多样化(例如诱变)过程。
[0013]因此，本专利技术描述了使病毒文库多样性最大化的新方法。
[0014]病毒基因组的多样性将使得能够开发具有新特性的新病毒，其可用于诸如高效选择性溶瘤病毒、疫苗、抗病毒疗法和基因治疗载体的应用。
[0015]在第一方面，提供了一种用于产生病毒文库的方法，该方法包含：
[0016](a)第一培养步骤，其包含在一个或多个细胞系上将来自第一双链DNA病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养，以及
[0017](b)组合以下两者
[0018](i)从步骤(a)获得的病毒，和
[0019](ii)来自一种或多种其它双链DNA病毒物种的每一个的相同物种的至少两种不同血清型的病毒，
[0020]其中第一双链DNA病毒物种和每种其它双链DNA病毒物种都是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生病毒文库的方法，所述方法包含：(a)第一培养步骤，其包含在一个或多个细胞系上将来自第一双链DNA病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养，以及(b)组合以下两者(i)从步骤(a)获得的病毒，和(ii)来自一种或多种其它双链DNA病毒物种中的每一种的相同物种的至少两种不同血清型的病毒，其中所述第一双链DNA病毒物种和每种其它双链DNA病毒物种都是相同双链DNA病毒科或属中的不同物种；以产生病毒文库；以及任选地(c)第二培养步骤，其中将在步骤(b)中组合的病毒在一个或多个细胞系上一起培养；以及(d)组合步骤(c)后获得的病毒或其部分，和/或从其中分离多种病毒，以产生病毒文库。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，将来自第一双链DNA病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养：(i)在单个细胞系上培养；(ii)在多个细胞系上培养，其中所述多个细胞系分别培养；或(iii)在多个细胞系上培养，其中所述多个细胞系一起培养。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，在步骤(b)(ii)中，对于所述一种或多种其它双链DNA病毒物种中的每种物种，来自所述物种的不同血清型的病毒是预先一起培养的病毒，其中不同物种的病毒预先独立培养。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)和(b)包含：(a)第一培养步骤，其包含(i)在一个或多个细胞系上将来自第一双链DNA病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养；以及(ii)在一个或多个细胞系上将来自一种或多种其它双链DNA病毒物种中的每一种的相同物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养，其中对于每种双链DNA病毒物种，将相同物种的不同血清型的病毒一起培养，并且将不同物种的病毒独立培养；以及(b)组合以下两者(i)来自步骤(a)(i)的病毒，和(ii)来自步骤(a)(ii)的病毒。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：步骤(b)另外包含将来自(i)和(ii)的病毒与来自以下的病毒组合：(iii)所述第一双链DNA病毒物种；(iv)与所述第一双链DNA病毒物种相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒；(v)一种或多种其它双链DNA病毒物种；和/或
(vi)与所述其它双链DNA病毒物种之一相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，将所述第一物种的病毒和每种其它物种的病毒一起培养：(i)在单个细胞系上培养；(ii)在多个细胞系上培养，其中所述多个细胞系分别培养；或(iii)在多个细胞系上培养，其中所述多个细胞系一起培养。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(d)另外包含将在步骤(c)后获得的病毒或其部分与来自以下的病毒组合：(i)所述第一双链DNA病毒物种；(ii)一种或多种其它双链DNA病毒物种；(iii)在培养步骤(a)后获得的一种或多种病毒；(iv)与所述第一双链DNA病毒物种相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒；和/或(v)与所述其它双链DNA病毒物种之一相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)、(b)和/或(c)中的一个或多个之前、期间或之后对所述病毒进行诱变。9.根据前...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：瑞罗特斯有限公司，
类型：发明
国别省市：