一种具有广谱抗菌活性的脂肽混合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有广谱抗菌活性的脂肽混合物，属于微生物技术领域。所述的脂肽混合物由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FJAT

【技术实现步骤摘要】
NO.M2021327。
[0008]所述的脂肽混合物由C
14
–
17
iturinA,C
14 fengycin B,C
16 fengycinA/A2,C
18
fengycin A,C
20 fengycinB2,C
21 fengycinA2,C
22
–
23
fengycinA,C
12
–
16
surfactin Aand C
15 surfactinA衍生物组成。
[0009]进一步的，所述的脂肽混合物中Iturin、Surfactin和Fengycin重量比分别为2.40
±
0.42％、30.08
±
5.22％和67.51
±
5.65％。
[0010]所述的脂肽混合物的分离纯化方法包括以下步骤：
[0011](1)菌株FJAT
‑
54560的活化：用接种环将贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560划线于NA培养基上，并于恒温培养箱中培养36
‑
60h，且培养温度设定为25
‑
35℃；NA培养基的组分为：牛肉浸膏0.2
‑
0.5％，蛋白胨0.2
‑
0.8％，葡萄糖0.5
‑
1.5％，琼脂1.5
‑
2.0％，以水配制，pH 7.0
‑
7.2，培养基组分中的百分比为重量比；
[0012](2)种子液的制备：将步骤(1)所获得的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560的单菌落接种于盛装有PDB培养基的三角瓶中，并将三角瓶置于恒温摇床振荡培养，转速150
‑
200rpm，温度设定为25
‑
35℃，培养20
‑
30h后即得种子液；所述的PDB培养基组分为：马铃薯浸粉0.2
‑
0.8％、蛋白胨0.5
‑
1.5％、氯化钠0.2
‑
0.8％、葡萄糖1.0
‑
2.0％，以水配制，pH 7.0
‑
7.2，培养基组分中的百分比均为重量比；
[0013](3)发酵液的制备：将步骤(2)所获得的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560的种子液接种到已灭菌的PDB培养基中，接种量0.8
‑
1.2％，搅拌速率150
‑
200rpm，温度设定为25
‑
35℃，培养36
‑
60h后，测定的菌体浓度值为4.0
×
108‑
6.0
×
108CFU/mL，则获得所需的发酵液；
[0014](4)脂肽混合物的制备：将步骤(3)得到的发酵液离心，转速为8000
‑
10000r/min；离心后弃去菌体得上清液，在上清液中加入1.5
‑
2.5mol/L盐酸至pH<2，2
‑
8℃静置15
‑
30h后，离心得到沉淀；利用低温真空冷冻干燥将沉淀进行干燥后，得脂肽混合物粉末；
[0015](5)脂肽混合物的粗提：用甲醇活化C
18
固相萃取小柱，后加入等体积纯水淋洗；向柱子中加入粗脂肽溶液；依次用水、10％
‑
100％甲醇溶液洗脱，收集60％
‑
80％甲醇溶液的洗脱液；
[0016](6)脂肽混合物的纯化：采用超高效液相色谱系统(UHPLC)分离收集到的洗脱液；色谱柱Welch Ultimate XB
‑
C18(4.6
×
250mm，5μm)，柱温22
‑
28℃；进样量50
‑
100μL；流速为0.8
‑
1.2mL/min；检测波长：200
‑
220nm；流动相A为0.8
‑
1.2
‰
三氟乙酸水；流动相B为含0.8
‑
1.2
‰
三氟乙酸的甲醇；洗脱程序为0min，40％A；10min，30％A；15min，30％A；25min，10％A；30min，10％A；35min，100％B；45min，100％B；收集保留时间为23～27min的洗脱液，即可得到Fengycin脂肽。
[0017]进一步的，所述的脂肽混合物的分离纯化方法优选为：
[0018](1)菌株的活化：贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560划线于NA培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，且培养温度设定为30℃；NA培养基的组分为：牛肉浸膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，琼脂1.8％，以水配制，pH 7.0
‑
7.2，培养基组分中的百分比为重量比；
[0019](2)种子液的制备：将上一步获得的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560的单菌落接种于盛装有PDB培养基的三角瓶中，并将三角瓶置于恒温摇床振荡培养，转速170rpm，温度设定为30℃，培养24h后即得种子液；所述的PDB培养基组分为：马铃薯浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、葡萄糖1.5％，以水配制，pH 7.0
‑
7.2，培养基组分中的百分比均为重量
比；
[0020](3)发酵液的制备：将上一步获得的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560的种子液接种到PDB培养基中，接种量1％，搅拌速率170rpm，温度设定为30℃，培养48h后，测定的菌体浓度值为5.0
×
108CFU/mL，则获得所需的发酵液；
[0021](4)脂肽混合物的制备：将上一步得到的发酵液离心，转速为9000r/min；离心后弃去菌体得上清液，在上清液中加入2mol/L盐酸至pH<2，4℃静置24h后，离心得到沉淀；利用低温真空冷冻干燥将沉淀进行干燥后，得脂肽混合物粉末；
[0022](5)脂肽混合物的粗提：用甲醇活化C
18
固相萃取小柱，后加入等体积纯水淋洗；向柱子中加入粗脂肽溶液；依次用水、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％及100％甲醇溶液洗脱，收集60％、70％、80％甲醇溶液的洗脱液；
[0023](6)脂肽混合物的纯化：采用UHPLC分离收集到的洗脱液；色谱柱Welch Ultimate XB
‑
C18(4.6
×
250mm，5μm)，柱温25℃；进样量60μL；流速为1mL/min；检测波长：205nm；流动相A为1
‰
三氟乙酸水；流动相B为含1
‰
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有广谱抗菌活性的脂肽混合物，其特征在于，所述的脂肽混合物由贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560(Bacillus velezensis FJAT
‑
54560)产生；所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560，于2021年4月6日保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2021327。2.根据权利要求1所述的具有广谱抗菌活性的脂肽混合物，其特征在于，所述的脂肽混合物由C
14
‑
17 iturin A,C
14 fengycin B,C
16 fengycin A/A2,C
18
fengycin A,C
20 fengycinB2,C
21 fengycinA2,C
22
–
23
fengycinA,C
12
–
16
surfactin A and C
15 surfactinA衍生物组成。3.根据权利要求1或2所述的具有广谱抗菌活性的脂肽混合物，其特征在于，所述的脂肽混合物的分离纯化方法包括如下步骤：菌株的活化：贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560划线于NA培养基上，并于恒温培养箱中培养36
‑
60h，且培养温度设定为25
‑
35℃；NA培养基的组分为：牛肉浸膏0.2
‑
0.5％，蛋白胨0.2
‑
0.8％，葡萄糖0.5
‑
1.5％，琼脂1.5
‑
2.0％，以水配制，pH 7.0
‑
7.2，培养基组分中的百分比为重量比；种子液的制备：将上一步获得的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT
‑
54560的单菌落接种于PDB培养基中，并置于恒温摇床振荡培养，转速150
‑
200rpm，温度设定为25
‑
35℃，培养20
‑
30h后即得种子液；所述的PDB培养基组分为：马铃薯浸粉0.2
‑
0.8％、蛋白胨0.5
‑
1.5％、氯化钠0.2
‑
0.8％、葡萄糖1.0
‑
2.0％，以水配制，pH 7.0
‑
7.2，培养基组分中的百分比均为重量...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈梅春，肖荣凤，陈燕萍，陈峥，王阶平，刘波，
申请(专利权)人：福建省农业科学院农业生物资源研究所，
类型：发明
国别省市：