一种高纯度dsRNA的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯度dsRNA的制备方法，本发明专利技术利用蛋白纯化平台，提供一种高纯度dsRNA的制备方法，主要包括菌体预处理，上样样品配制，I型阴离子柱收集流穿和吸附，II型阴离子柱收集吸附，切向流浓缩和置换。制备的dsRNA纯度高，收率高，得到的dsRNA纯度在90％以上，为dsRNA使用纯化平台制备提供了可靠方法。本发明专利技术缓冲液中使用钾盐，相较于钠盐，洗脱力更强；并且本发明专利技术的处理量更大，可以放大到300L的柱子，一次处理400kg菌体，甚至更大，有利于生产使用；本发明专利技术收率更高，是老工艺的8倍；使用的有机溶剂更少，节省成本而且环保。节省成本而且环保。节省成本而且环保。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度dsRNA的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种高纯度dsRNA的制备方法，属于纯化


技术介绍

[0002]RNA干扰技术(RNAsilencing)也叫基因沉默技术，近年的研究发现，将mRNA对应的正义链和反义链组成的双链RNA(dsRNA)进行细胞转化后，可以使该mRNA特异性降解，使其对应的基因沉默，这项技术在医药和农业领域有非常广泛的应用前景。制备高浓度高纯度的dsRNA具有非常重要的意义。
[0003]目前，dsRNA纯化方法主要有以下几种：(1)用TRIzol试剂提纯动植物组织中的总RNA，然后用DNA酶和RNA酶消化总RNA，除去DNA和单链RNA而获得dsRNA，但是这种方法提取dsRNA的质量和效率非常低；(2)提取的总RNA用氯化锂或氯化铯进行密度梯度离心的方法提取纯化dsRNA；但是这种方法提取dsRNA的数量有限、操作繁琐、费用昂贵；(3)用纤维素粉吸附dsRNA的纯化方法，提取总核酸，然后用纤维素粉吸附提取其中的dsRNA，但是该方法需要反复悬浮、离心纤维素粉后吸除上清的方式去除纤维素粉上吸附的ssRNA和DNA，这个过程耗时较长、操作繁琐、且在反复悬浮吹打纤维素粉的过程中会损失较多dsRNA，纯化效率很低。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术利用蛋白纯化平台，提供一种高纯度dsRNA的制备方法，制备的dsRNA纯度高，收率高，得到的dsRNA纯度在90％以上，为dsRNA使用纯化平台制备提供了可靠方法。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种高纯度dsRNA的制备方法，包括如下步骤：
[0006]S1、采用缓冲液1对菌体进行破壁预处理，离心收集上清液；
[0007]S2、采用缓冲液2将S1步骤收集的上清液中钾离子浓度调整在120mM
‑
320mM，得到待上样样品；
[0008]S3、采用缓冲液A平衡I型阴离子柱，将样品上样至I型阴离子柱，并采用缓冲液A清洗得到含有目标dsRNA的清洗液，收集清洗液；再使用缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液；
[0009]S4、采用缓冲液C平衡II型阴离子柱，将S3步骤的清洗液和洗脱液混合后上样至II型阴离子柱，采用缓冲液C清洗，清洗后使用缓冲液D进行洗脱，收集洗脱液；
[0010]S5、将S4步骤的洗脱液进行浓缩，得到高纯度dsRNA浓缩液；
[0011]其中，缓冲液1、缓冲液2、缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C和缓冲液D中均包括钾盐。
[0012]在本专利技术中，I型阴离子柱上样饱和后，使用缓冲液A先清洗得到含有目标dsRNA和比目标dsRNA分子量小的核酸杂质的清洗液，此时比目标dsRNA分子量大的杂质会被牢固结合在填料上，再使用缓冲液B洗脱下剩余的目标dsRNA，大分子核酸杂质结合更强不会被洗脱。再将I型阴离子柱洗脱的清洗液和洗脱液上样至II型阴离子柱，上样饱和后，使用缓冲液C清洗掉比目标dsRNA分子量小的核酸杂质，再使用缓冲液D进行洗脱，收集含有目标
dsRNA的洗脱液。
[0013]进一步地，I型阴离子柱的填料为单分散聚丙烯酸酯，按照粒径40～60：粒径80～100＝0.2～5混匀得到。
[0014]进一步地，II型阴离子柱的填料为粒径15～25的琼脂糖凝胶。
[0015]进一步地，缓冲液A由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为120mM
‑
280mM。
[0016]进一步地，缓冲液B由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为160mM
‑
320mM。
[0017]进一步地，缓冲液C由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为160mM
‑
280mM。
[0018]进一步地，缓冲液D由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为200mM
‑
320mM。
[0019]进一步地，菌体破壁预处理时，调节pH至7
‑
10，菌体分散悬浮，加热至40
‑
80℃，维持3
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20min，使用冰浴降温至20
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30℃，超声处理5
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30min，在0℃
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25℃、9000
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15000rpm离心5min
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60min，收集上清液。
[0020]进一步地，缓冲液1由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为50mM
‑
300mM。
[0021]进一步地，缓冲液2由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为50mM
‑
300mM。
[0022]本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术利用蛋白纯化平台，提供一种高纯度dsRNA的制备方法，主要包括菌体预处理，上样样品配制，I型阴离子柱收集流穿和吸附，II型阴离子柱收集吸附，切向流浓缩和置换。制备的dsRNA纯度高，收率高，得到的dsRNA纯度在90％以上，为dsRNA使用纯化平台制备提供了可靠方法。本专利技术缓冲液中使用钾盐，相较于钠盐，洗脱力更强；并且本专利技术的处理量更大，可以放大到300L的柱子，一次处理400kg菌体，甚至更大，有利于生产使用；本专利技术收率更高，是老工艺的8倍；使用的有机溶剂更少，节省成本而且环保。
附图说明
[0024]图1为纯化前dsRNA上样样品的色谱图；
[0025]图2为I型阴离子柱纯化后dsRNA样品的色谱图；
[0026]图3为II型阴离子柱纯化后dsRNA样品的色谱图。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0028]本专利技术实施例中使用的是表达烟草花叶病毒dsRNA的大肠杆菌菌体。
[0029]缓冲液A(氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种构成，钾离子浓度调整在120mM
‑
280mM浓度范围内)
[0030]缓冲液B(氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇
胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种构成，钾离子浓度调整在160mM
‑
320mM浓度范围内)
[0031]缓冲液C(氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯度dsRNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、采用缓冲液1对菌体进行破壁预处理，离心收集上清液；S2、采用缓冲液2将S1步骤收集的上清液中钾离子浓度调整在120mM
‑
320mM，得到待上样样品；S3、采用缓冲液A平衡I型阴离子柱，将样品上样至I型阴离子柱，并采用缓冲液A清洗得到含有目标dsRNA的清洗液，收集清洗液；再使用缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液；S4、采用缓冲液C平衡II型阴离子柱，将S3步骤的清洗液和洗脱液混合后上样至II型阴离子柱，采用缓冲液C清洗，清洗后使用缓冲液D进行洗脱，收集洗脱液；S5、将S4步骤的洗脱液进行浓缩，得到高纯度dsRNA浓缩液；其中，缓冲液1、缓冲液2、缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C和缓冲液D中均包括钾盐。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，I型阴离子柱的填料为单分散聚丙烯酸酯，按照粒径40～60：粒径80～100＝0.2～5混匀得到。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，II型阴离子柱的填料为粒径15～25的琼脂糖凝胶。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，缓冲液A由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为120mM
‑
280mM。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，缓冲液B由氯化钾，碳酸钾，碳酸钾，碳酸氢钾，盐酸，三羟甲基氨基甲烷，氨基乙醇胺，乙二胺，咪唑中的一种或几种组成，钾离子浓度为160mM
‑
320mM。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：秦斌钰，唐雪明，黄永奎，亢升明，
申请(专利权)人：硅羿科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：