本发明专利技术涉及编码RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子，其是(a)编码包含SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列组成的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(b)包含SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列或由SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列组成的核酸分子；(c)编码氨基酸序列与(a)的氨基酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(d)包含与(b)的核苷酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的核苷酸序列或由与(b)的核苷酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的核苷酸序列组成的核酸分子；(e)相对于(d)的核酸分子简并的核酸分子；(f)对应于(a)至(d)中任一项的核酸分子的核酸分子，其中T被U替代。其中T被U替代。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因组编辑的新颖的非天然存在的CRISPR
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CAS核酸酶
[0001]本专利技术涉及编码RNA引导的DNA核酸内切酶(RNA
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guided DNA endonuclease)的核酸分子，其是(a)编码包含SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列组成的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(b)包含SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列或由SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列组成的核酸分子；(c)编码氨基酸序列与(a)的氨基酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(d)包含与(b)的核苷酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的核苷酸序列或由与(b)的核苷酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的核苷酸序列组成的核酸分子；(e)相对于(d)的核酸分子简并的核酸分子；(f)对应于(a)至(d)中任一项的核酸分子的核酸分子，其中T被U替代。
技术介绍
[0002]在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册的多个文献。这些文献的公开虽然被认为与本专利技术的可专利性无关，但通过引用以其整体并入本文。更具体地，所有引用的文献被引用并入的程度与每个单独的文献被具体地和单独地指明被引用并入一样。
[0003]CRISPR
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Cas系统是原核生物针对侵入的外来核酸的广泛适应性免疫系统。到目前为止，已经鉴别了超过30种不同的CRISPR
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Cas系统，它们的基因座结构、数量和编码Cas(CRISPR相关)蛋白的基因的特性(identity)各不相同。
[0004]CRISPR系统在原核基因组中的典型特征是存在短的(30
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45bp)重复序列(重复段，repeats)，这些序列插入有相似长度的可变序列(间隔子(spacer))。Cas蛋白位于重复段
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间隔子簇的上游或下游。根据它们的基因组成和机制差异，这些亚型分为两个CRISPR类(1类和2类)。它们的主要区别之一是1类CRISPR系统需要多个Cas蛋白的复合物来降解DNA，而2类Cas蛋白是单独的大的多结构域核酸酶。2类Cas蛋白的序列特异性可以通过合成的CRISPR RNA(crRNA)简单地进行修饰，以引入靶向的双链DNA断裂。此类2类Cas蛋白的最著名成员是Cas9、Cpf1(Cas12a)和Cms1，它们被用于基因组编辑，并被成功应用于许多真核生物，包括真菌、植物和哺乳动物细胞。Cas9及其同源物是2类II型CRISPR核酸酶，而Cpf1(WO2016/205711BROAD Inst.；WO2017/141173Benson Hill)和Cms1(WO2019/030695Benson Hill)属于2类V型核酸酶。Cms1和Cpf1 CRISPR核酸酶是一类与其它CRISPR核酸酶(例如II型核酸酶)相比具有某些理想特性的CRISPR核酸酶。例如，与Cas9核酸酶相比，Cms1和Cpf1不需要反式激活crRNA(trans
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activating crRNA，tracrRNA)，它与前体crRNA(pre
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crRNA)部分互补(Deltcheva等人(2011),Nature,471(7340)):602
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607)。tracrRNA和pre
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crRNA的碱基配对形成Cas9结合的RNA：RNA双链体，由RNase III和其它未鉴别的核酸酶处理。这种成熟的tracrRNA：crRNA双链体介导Cas9对靶DNA的识别和切割。相反，V型核酸酶无需tracrRNA或细胞核酸酶(如RNase III)即可处理pre
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crRNA，这显著简化了V型核酸酶用于(多重)基因组编辑的应用。
[0005]已在培养的细菌的基因组或公共可用的宏基因组数据集(例如肠道宏基因组)中
鉴别出多个新的2类蛋白，如C2c1(Cas12b)、C2c2(Cas13a)和C2c3(Cas12c)(Shmakov等人(2015),Mol Cell,60(3):385
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97)。根据最近的CRISPR
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Cas系统分类，2类包含3个型和17个亚型(Makarova等人(2020),Nat Rev Microbiol,18(2):67
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83)。
[0006]此外，在最近发表的一篇文章中，通过宏基因组测序在未培养的原核生物中发现了两种新的2类蛋白(CasX(Cas12a)和CasY(Cas12d))(Burstein等人(2017),Nature,542:237
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241)，表明尚未培养和/或鉴别的生物体中存在未开发的Cas蛋白。
[0007]如所讨论的，已知的CRISPR
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Cas系统在其作用模式上表现出某些差异。这些分子差异不仅扩展了在广泛的不同遗传背景下使用CRISPR
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Cas系统用于基因组编辑的可能性，而且在应用于某些生物体时规避了特定Cas核酸酶的问题，例如在人中预先存在的对Cas9的免疫响应(Charlesworth等人(2019),Nat Med,25(2):249
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254)。因此，从与高等真核生物较少直接接触或非天然来源的细菌物种中鉴别Cas核酸酶尤为重要。可以假设具有未知特征的CRISPR
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Cas系统在自然界中存在或可以通过蛋白质工程设计。因此，尽管从现有技术中已知几种不同的CRISPR
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Cas系统，但仍然需要鉴别进一步的RNA引导的DNA核酸内切酶。
技术实现思路
[0008]相应地，本专利技术在第一方面涉及编码RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子，其是(a)编码包含SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列组成的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(b)包含SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列或由SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列组成的核酸分子；(c)编码氨基酸序列与(a)的氨基酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(d)包含与(b)的核苷酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的核苷酸序列或由与(b)的核苷酸序列至少90％、优选至少92％和最优选至少95％相同的核苷酸序列组成的核酸分子；(e)相对于(d)的核酸分子简并的核酸分子；(f)对应于(a)至(d)中任一项的核酸分子的核酸分子，其中T被U替代。
[0009]SEQ ID NO:1、3和29分别为新颖的CRISPR
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Cas核酸内切酶BEC85、BEC67和BEC10的氨基酸序列，其中BEC为BRAIN Engineere本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子，其是(a)编码包含SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:29、1或3的氨基酸序列组成的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(b)包含SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列或由SEQ ID NO:30、2或4的核苷酸序列组成的核酸分子；(c)编码氨基酸序列与(a)的氨基酸序列至少93％且最优选至少95％相同的RNA引导的DNA核酸内切酶的核酸分子；(d)包含与(b)的核苷酸序列至少93％且最优选至少95％相同的核苷酸序列或由与(b)的核苷酸序列至少93％且最优选至少95％相同的核苷酸序列组成的核酸分子；(e)相对于(d)的核酸分子简并的核酸分子；或(f)对应于(a)至(d)中任一项的核酸分子的核酸分子，其中T被U替代。2.权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至对于所述核酸分子是天然的或异源的启动子。3.权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述核酸分子针对真核细胞中、优选植物细胞或动物细胞中的表达进行了密码子优化。4.一种载体，其编码权利要求1至3中任一项所述的核酸分子。5.一种宿主细胞，其包含权利要求1至3中任一项所述的核酸分子或转化、转导或转染有权利要求4所述的载体。6.权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞，优选是植物细胞或动物细胞。7.一种植物、种子或植物的一部分、或者动物，其包含权利要求1至3中任一项所述的核酸分子或转化、转导或转染有权利要求4所述的载体，所述植物的一部分不是单个植物细胞。8.一种产生RNA引导的DNA核酸内切酶的方法，其包含培养权利要求5或6所述的宿主细胞并分离所产生的RNA引导的DNA核酸内切酶。9.一种RNA引导的DNA核酸内切酶，其由...
【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：BRAIN生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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