一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法技术

本发明专利技术提供一种基于磁珠法的无醇核酸提取试剂盒及其应用方法，该试剂盒包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液和洗脱液，可用于病毒核酸提取，也可用于全血、细胞、唾液、组织等样本基因组提取，应用范围广。本发明专利技术还提供了采用上述试剂盒提取核酸的方法，首先将样本、磁珠和裂解液混合进行样本裂解液核酸释放的同时，实现磁珠的边捕获结合，然后通过无乙醇、异丙醇等醇类特定的洗涤液进行除蛋白、盐、小分子等杂质，最后将纯的核酸溶解于洗脱液中，用于下游检测。该方法操作简单，整个操作过程不需要使用乙醇、异丙醇等有机试剂。异丙醇等有机试剂。异丙醇等有机试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法


[0001]本专利技术涉及医药生物
，尤其涉及一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法。

技术介绍

[0002]在分子生物学实验中，核酸提取是一项最基本且最重要的环节，核酸提取的质量直接关系到下游核酸检测、生物学研究或其他新产品开发的成败。目前最常用的核酸提取方法是磁珠法和硅胶膜柱式法。硅胶膜柱式法提取获得的核酸纯度高，但是对小片段DNA或RNA提取效率不高，而且不适用于自动化提取流程。磁珠法核酸提取是以超顺磁性氧化硅纳米微球(简称磁珠)为载体，通过磁珠吸附核酸，经过磁性分离和漂洗杂质后，核酸从磁珠表面释放的原理进行核酸提取的方法。该方法不需离心，操作简单，便于高通量、自动化操作，可以使核酸提取效率显著升高，已成为目前新兴的核酸提取技术。
[0003]目前核酸提取的过程中最常用的促进磁珠和核酸结合的溶剂以及清洗液中多含有异丙醇和乙醇等易挥发有机溶剂，对于乙醇、异丙醇的使用存在如下问题：(1)醇残留抑制反应：乙醇、异丙醇等醇的残留，对下游检测的酶反应具有较大的抑制作用，从而影响检测结果的准确性；(2)运输问题：乙醇和异丙醇属于易燃易挥发的液体，其蒸气能与空气形成爆炸性混合物，因此洗涤液中含有较高浓度的乙醇或异丙醇造成该试剂的运输不方便，很多试剂厂家为解决运输问题，对于瓶装试剂盒均由客户自备乙醇或异丙醇按照标签试剂量加入到试剂瓶中，给终端客户的使用增加成本和步骤，同时加入试剂的准确性以及试剂的纯度均会对结果产生较大影响；(3)保存问题：含醇类瓶装试剂在使用过程中反复开盖造成醇的挥发，含醇量减少影响提取核酸浓度降低，同时使用预封装试剂当前均采用铝膜对深孔板进行封膜，乙醇的存在随储存时间的延长，铝膜逐渐出现分层，导致客户在使用过程中存在内层膜分离残留至孔上，不利于提取操作，且膜残留造成孔小易导致磁珠在吸附磁珠时蹭到残留的铝膜，增加了提取过程中交叉污染的风险。
[0004]对于无醇核酸提取试剂近两年也出现相关报道，如CN109722431A和CN114164207A等两篇专利阐述了对于病毒类小片段样本的试剂进行阐述，而对于复杂样本如全血、唾液、组织等样本类型基因组大片段提取均为进行阐明；CN113462683A报道了适用多种样本核酸提取的无醇清洗液，但其提取试剂盒中含有DTT等有刺激性气味的有毒试剂，因此，针对上述存在的问题，本专利技术提供一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法。

技术实现思路

[0005]针对上述不足，本专利技术的目的是提供一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法。
[0006]本专利技术提供了如下的技术方案：
[0007]一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒，包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液以及洗脱液；
[0008]所述裂解液包括以下组分：异硫氰酸胍1～3mol/L、盐酸胍1～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～100mmol/L、醋酸钠0.5～2mol/L、月桂醇聚醚
‑
21 1～10％v/v、Tween 20 0.5～5％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；
[0009]所述第一洗涤液包括以下组分：异硫氰酸胍1～4mol/L、Triton X
‑
100 0.5～2％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；
[0010]所述第二洗涤液包括以下组分：PEG 1500 5～30％w/v、氯化钠50
‑
500mmol/L、HEPES 10
‑
100mmol/L；
[0011]所述第三洗涤液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～
[0012]100mmol/L；
[0013]所述洗脱液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～50mmol/L、EDTA 1～10mmol/L。
[0014]一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒的核酸提取方法，包括如下步骤：
[0015]S1.一个对全血、血清、血浆、拭子保存液等样本中病毒进行裂解：在1.5ml或2ml离心管中加入200
‑
300μL的样本，再向离心管中加入500μL的裂解液、10
‑
30μL(50mg/ml)磁珠溶液、10
‑
30μL蛋白酶K(10mg/ml)溶液，置于恒温振荡混匀仪上，50
‑
65℃恒温振荡孵育5
‑
15min；
[0016]S2.去蛋白洗涤步骤：将步骤S1的离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入600～800μL第一洗涤液，振荡混匀1～2min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；
[0017]S3.去盐离子洗涤：将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入600～800μL第二洗涤液，振荡混匀1～2min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体，保持离心管在磁力架上，向离心管缓慢加入600～800μL第三洗涤液，静置10
‑
30秒，吸弃液体；
[0018]S4.核酸洗脱：将步骤S3离心管从磁力架上取下，向离心管加入30
‑
100μL洗脱液，移液器吹吸混匀后，置于恒温振荡混匀仪上，55℃振荡孵育5
‑
10min，将离心管放置于磁力架上静置1
‑
2min至磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至新的无酶离心管中，及得核酸溶液，可用于下游检测或保存待用。
[0019]结合基于上述提取方法的自动化核酸提取仪使用操作步骤如下：
[0020]F1.试剂板准备：将1个试剂盒内含有的6个深孔板分别进行预封装处理，将经过预分装处理的深孔板工位2磁珠预封板颠倒混匀，然后将所有预封装试剂板瞬时离心，甩去封装膜和孔壁的液体后，撕开深孔板封膜；
[0021]F2.加入样本：向预封装试剂板工位1裂解液板中加入待提取样本和蛋白酶K；
[0022]F3.上机自动提取：将试剂板放入仪器内，安装磁套，选择提取程序，点击运行，即可实现自动化核酸提取；
[0023]F4.收集核酸：核酸提取完毕后，取出6个深孔板，其中工位6中的溶液即为核酸溶液，可用于下游检测或保存待用。
[0024]所述步骤F1中的6个预封装处理的试剂板如下：
[0025]工位1裂解液的深孔板内装入400～600μL裂解液；
[0026]工位2磁珠的深孔板内装入400～500μL磁珠溶液；
[0027]工位3第一洗涤液的深孔板内装入600～800μL第一洗涤液；
[0028]工位4第二洗涤液的深孔板内装入600～800μL第二洗涤液；
[0029]工位5第三洗涤液的深孔板内装入600～800μL第三洗涤液；
[0030]工位6洗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液、第三洗涤液以及洗脱液；所述裂解液包括以下组分：异硫氰酸胍1～3mol/L、盐酸胍1～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～100mmol/L、醋酸钠0.5～2mol/L、月桂醇聚醚
‑
21 1～10％v/v、Tween20 0.5～5％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；所述第一洗涤液包括以下组分：异硫氰酸胍1～4mol/L、Triton X
‑
100 0.5～2％v/v、PEG 1500 5～20％w/v；所述第二洗涤液包括以下组分：PEG 1500 5～30％w/v、氯化钠50
‑
500mmol/L、HEPES 10
‑
100mmol/L；所述第三洗涤液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～100mmol/L；所述洗脱液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷醋酸盐10～50mmol/L、EDTA 1～10mmol/L。2.基于权利要求1所述磁珠法无醇核酸提取试剂盒的核酸提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.一个对全血、血清、血浆、拭子保存液等样本中病毒进行裂解：在1.5ml或2ml离心管中加入200
‑
300μL的样本，再向离心管中加入500μL的裂解液、10
‑
30μL(50mg/ml)磁珠溶液、10
‑
30μL蛋白酶K(10mg/ml)溶液，置于恒温振荡混匀仪上，50
‑
65℃恒温振荡孵育5
‑
15min；S2.去蛋白洗涤步骤：将步骤S1的离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～60秒至磁珠完全吸附，吸弃液体；将离心管从磁力架上取下，向离心管内加入600～800μL第一洗涤液，振荡混匀1～2min，将离心管放置于磁力架上，上下颠倒冲刷管盖和管壁残留磁珠，然后静置30～6...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋莲，孙小爱，翁国武，季昱，
申请(专利权)人：南京中科拜尔医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：