一种适用于罗尔斯通式菌基因组进化的系统、应用及基因组进化方法技术方案

本发明专利技术公开了一种适用于罗尔斯通式菌基因组进化的系统、应用及基因组进化方法。本发明专利技术适用于罗尔斯通式菌基因组进化的系统包括用于将编码胞嘧啶脱氨酶的基因和编码特异性单链DNA结合蛋白的基因进行融合表达的表达载体。利用本发明专利技术建立的基因组进化方法，对罗尔斯通式菌基因组进行连续进化，在操作上具有简单、高效等优点；在功能上，能提高底物消耗速率、扩展底物谱、增强对有机试剂、氧化剂及电微生物系统等生长环境的耐受性，有助于后续的合成生物学改造。所以，使用本发明专利技术的基因组进化方法能够造成菌体性状和功能的多样性，根据工业生产要求，可对某一性状(如菌株鲁棒性和生物合成效率)进行连续筛选和定向进化。物合成效率)进行连续筛选和定向进化。物合成效率)进行连续筛选和定向进化。

【技术实现步骤摘要】
J，et al.Helicase
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AID：A novel molecular device for base editing at random genomic loci[J].Metabolic Engineering，2021，67：396
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402)等，但目前这些方法还未被应用于罗氏菌。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了种适用于罗尔斯通式菌基因组进化的系统、应用及基因组进化方法，能够简单、高效地提高罗尔斯通式菌的鲁棒性和生物合成效率。
[0007]一种适用于罗尔斯通式菌(Cupriavidus necator H16)基因组进化的系统，包括用于将编码胞嘧啶脱氨酶的基因和编码特异性单链DNA结合蛋白的基因进行融合表达的表达载体，
[0008]所述编码胞嘧啶脱氨酶的基因为：大鼠(Rattus norvegicus)来源的胞嘧啶脱氨酶编码基因APOBEC或七鳃鳗(Lampetra japonicum)来源的胞嘧啶脱氨酶编码基因PmCDA；
[0009]所述编码特异性单链DNA结合蛋白的基因来源于罗尔斯通氏菌，具体为以下任一种：(1)DNA解旋酶dnaB；(2)DNA引物酶dnaG；(3)单链结合蛋白SSB；(4)单链结合蛋白h16_A0402。
[0010]其中，将两个基因进行融合表达是指两个基因的编码序列直接相连或者中间通过连接序列进行连接，转录并翻译成两个蛋白融合在一起的融合蛋白质。优选的，两个蛋白质融合的时候中间通过连接肽相连，这样可以减少两个蛋白直接相互之间的影响。对应的，两个基因中间加入编码连接肽的基因序列，比如，采用BE4质粒上的XTEN linker来连接。
[0011]优选的，PmCDA或APOBEC基因的核苷酸序列根据罗尔斯通式菌进行密码子优化。
[0012]优选的，胞嘧啶脱氨酶编码基因APOBEC的基因序列如SEQ ID No.1(野生型序列)或SEQ ID No.2(根据罗尔斯通式菌进行密码子优化后的序列)所示；
[0013]胞嘧啶脱氨酶编码基因PmCDA(根据罗尔斯通式菌进行密码子优化后的序列)的基因序列如SEQ ID No.3所示；
[0014]DNA解旋酶dnaB的基因序列如SEQ ID No.4所示；
[0015]DNA引物酶dnaG的基因序列如SEQ ID No.5所示；
[0016]单链结合蛋白SSB的基因序列如SEQ ID No.6所示；
[0017]单链结合蛋白h16_A0402的基因序列如SEQ ID No.7所示。
[0018]优选的，所述系统为重组表达质粒，包括质粒骨架和编码胞嘧啶脱氨酶的基因、编码特异性单链DNA结合蛋白的基因，其中，编码胞嘧啶脱氨酶的基因和编码特异性单链DNA结合蛋白的基因进行融合表达。
[0019]本专利技术又提供了所述系统在提高罗尔斯通式菌菌株鲁棒性和生物合成效率中的应用。
[0020]本专利技术还提供了一种转基因罗尔斯通式菌，转入了所述系统。
[0021]本专利技术还提供了所述转基因罗尔斯通式菌作为底盘菌株在筛选获得高鲁棒性和/或生物合成效率的菌株中的应用。
[0022]本专利技术还提供了一种适用于罗尔斯通式菌的基因组进化方法，根据目标对所述转基因罗尔斯通式菌进行连续筛选和定向进化，获得高鲁棒性和/或生物合成效率的菌株。优
选的，所述目标为提高菌株对底物消耗速率、扩展底物谱、增强对有机试剂、氧化剂或电微生物系统的耐受性。更优选的，所述有机试剂为异丙醇、异丁醇和加酸中的至少一种，所述氧化剂为过氧化氢。
[0023]利用本专利技术建立的基因组进化方法，对罗尔斯通式菌基因组进行连续进化，在操作上具有简单、高效等优点；在功能上，能提高底物消耗速率、扩展底物谱、增强对有机试剂、氧化剂及电微生物系统等生长环境的耐受性，有助于后续的合成生物学改造。
[0024]所以，使用本专利技术的基因组进化方法能够造成菌体性状和功能的多样性，根据工业生产要求，可对某一性状(如菌株鲁棒性和生物合成效率)进行连续筛选和定向进化。
附图说明
[0025]图1为pBBR
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P
ara
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APOBECRe(a)与pBBR
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P
ara
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PmCDARe(b)的质粒图谱。
[0026]图2为pBBR
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P
ara
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APOBECRe与不同单链结合蛋白基因的质粒图谱，其中，a为APOBECRe
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dnaB；b为APOBECRe
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dnaG；c为APOBECRe
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S SB；d为APOBECRe
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A0402。
[0027]图3为不同脱氨酶对罗氏菌转化效率(a)和生长速率(b)的影响情况检测结果图。
[0028]图4为罗氏菌中不同基因组进化系统的生长曲线(a)和相对突变率(b)检测结果图。
[0029]图5为罗氏菌基因组突变菌株在含不同浓度异丙醇和异丁醇培养基中的生长情况检测结果图。
[0030]图6为罗氏菌基因组突变菌株在含不同浓度甲酸钠培养基中的生长情况检测结果图。
[0031]图7为不同基因组进化工具对提高罗氏菌H2O2耐受性的效果检测结果图。
[0032]图8为利用APOBECRe
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dnaB对H2O2耐受性连续进化的效果检测结果图。
[0033]图9为利用APOBECRe
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dnaB在MES中连续进化的效果检测结果图。
[0034]图10为基因组进化提高罗氏菌在MES体系中mBDO产量的应用检测结果图，其中，a为生长情况；b为mBDO产量。
具体实施方式
[0035]质粒pBBR1MCS
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2购自Addgene。用于构建质粒的大肠杆菌DH5α购自北京擎科生物科技有限公司。罗尔斯通氏菌Ralstonia eutropha H16购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。DNA polymerase、限制性内切酶与T4连接酶购买自NEB公司。质粒提取试剂盒购买自AXYGEN有限公司，PCR产物核酸纯化试剂盒购买自Thermo Scientific公司。
[0036]大肠杆菌的培养基使用LB培养基，配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。
[0037]罗尔斯通氏菌使用MM培养基，配方为：9g/LNa2HPO4·
12H2O，1.5g/LKH2PO4，1g/L(NH4)2SO4，80mg/L MgSO4·
7H2O，1mg/L CaSO4·
2H2O，0.56mg/L NiSO4·
7H2O，0.4mg/L柠檬酸铁，200mg/L NaHCO3，1mL/L微量元素(1.5g/L NTA，0.3g/L H3BO3，0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于罗尔斯通式菌(Cupriavidus necator H16)基因组进化的系统，其特征在于，包括用于将编码胞嘧啶脱氨酶的基因和编码特异性单链DNA结合蛋白的基因进行融合表达的表达载体，所述编码胞嘧啶脱氨酶的基因为：大鼠(Rattus norvegicus)来源的胞嘧啶脱氨酶编码基因APOBEC或七鳃鳗(Lampetra japonicum)来源的胞嘧啶脱氨酶编码基因PmCDA；所述编码特异性单链DNA结合蛋白的基因来源于罗尔斯通氏菌，具体为以下任一种：(1)DNA解旋酶dnaB；(2)DNA引物酶dnaG；(3)单链结合蛋白SSB；(4)单链结合蛋白h16_A0402。2.根据权利要求1所述适用于罗尔斯通式菌基因组进化的系统，其特征在于，PmCDA或APOBEC基因的核苷酸序列根据罗尔斯通式菌进行密码子优化。3.根据权利要求1所述适用于罗尔斯通式菌基因组进化的系统，其特征在于，胞嘧啶脱氨酶编码基因APOBEC的基因序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；胞嘧啶脱氨酶编码基因PmCDA的基因序列如SEQ ID No.3所示；DNA解旋酶dnaB的基因序列如SEQ ID No.4所示；DNA引物酶dnaG的基因序列如SEQ ID No.5所示；单链结合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：连佳长，汪之骄，潘浩杰，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：