构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体涉及构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株。本申请通过对罗尔斯通氏菌基因组中编码N

【技术实现步骤摘要】
构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株


[0001]本专利技术涉及农业生物
，具体涉及构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法及菌株。

技术介绍

[0002]化石燃料的大量使用所释放的温室气体(如CO2)所导致的气候变化是造成极端天气出现的主要因素。通过技术手段来消除大气中的CO2同时利用其作为原料进行燃料、糖及生物活性物质的生产是一种一举两得的手段。光催化和电催化方法为将CO2转化为化学品或染料提供了可行途径。然而，通过该类方式进行CO2的转化需要大量能源的输入。基于微生物细胞工厂的碳回收技术更有应用潜力。最近有报道表明通过代谢工程手段改造后的罗尔斯通氏菌H16能够将CO2直接转化为高价值的化学品。
[0003]肌醇(顺
‑
1,2,3,5
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反
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4,6环己醇)是一种具有五个平面羟基和一个轴向羟基的环多醇。目前，利用体外酶法合成肌醇的路线已被建立起来。然而，体外酶法具有酶寿命短、肌醇分离困难、反应速度慢等缺陷。随着合成生物学技术的发展，利用代谢工程手段直接将可再生原料高效且廉价地转化为肌醇逐渐成为可能。目前已有利用代谢工程手段生产肌醇的报道见于以大肠杆菌和毕赤酵母为宿主菌株。碳源包括纤维素、淀粉和葡萄糖等。但目前尚无利用廉价的可再生碳源甘油或温室气体之一的CO2作为唯一碳源进行肌醇合成的相关报道。
[0004]罗尔斯通氏菌H16(Cupriavidus necator H16)是一种兼性化能自养的革兰氏阴性菌株。由于其缺失6
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磷酸果糖激酶和6
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磷酸葡糖酸脱氢酶，造成了其缺失完整的糖酵解途径和磷酸戊糖途径。葡萄糖
‑6‑
磷酸的代谢经由Entner
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Doudoroff(ED)途径生成丙酮酸而后进入三羧酸循环或供给聚([R]‑
3羟基丁酸)合成。作为一个具有潜在“细胞农业”候选菌株，罗尔斯通氏菌H16能够利用广泛的有机物作为碳源(如甘油等)，更为重要的是其通过Calvin
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Benson
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Bassham(CBB)循环可以直接以CO2作为碳源。由于缺少葡萄糖转运蛋白，其野生型菌株无法利用葡萄糖作为碳源。罗尔斯通氏菌H16具有一个天然PHB合成途径，通过代谢途径的重构，可将该部分碳流量转向合成其他高附加值化合物。目前，利用代谢工程改造后的罗尔斯通氏菌H16已成功实现了以甘油或CO2为碳源的异丁醇、甲基酮、海藻糖和甘露糖等的合成。

技术实现思路

[0005]为实现利用可再生物质及温室气体CO2进行肌醇生产，本专利技术的目的是提供构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法。
[0006]本专利技术的再一目的是提供提供构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌。
[0007]根据本专利技术的构建产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将罗尔斯通氏菌基因组中编码N
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乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE(H16_A0312)进行突变，使其编码的蛋白质的第265位氨基酸由G突变为R，并敲除编码GntR家族的转录调节因子nagR(H16_A0310)，使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖，其中，所述N
‑
乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的编码基因为nagE(H16_A0312)编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2，所述GntR家族的转录调节因子的编码基因为nagR(H16_A0310)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0009](2)异源表达酿酒酵母来源的肌醇
‑3‑
磷酸合酶(ScIPS)基因或大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶(EcIMP)基因，构建突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞，其中，所述酿酒酵母来源的肌醇
‑3‑
磷酸合酶(ScIPS)基因为酿酒酵母来源的肌醇
‑3‑
磷酸合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶(EcIMP)基因为大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0010]根据本专利技术的构建产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，进一步包括以下步骤：
[0011]敲除ED途径和/或PHB合成途径中的关键基因，其中，
[0012]所述ED途径关键基因为葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的编码基因zwf1(H16_A0316)、zwf2(H16_B1501)和zwf3(H16_B2566)，所述葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的编码基因zwf1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述zwf2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述zwf3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
[0013]所述PHB合成途径关键基因为聚([R]‑
3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1(H16_A1437)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA(H16_A1438)和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1(H16_A1439)，所述聚([R]‑
3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
[0014]SEQ ID NO：1(nagE编码氨基酸序列)
[0015]SEQ ID NO：1
[0016]MKMDLLPRVQRLGATLMLPIAVLPVAGLLLRLGQPDVFDIKLMAEAGNAVFANLALLFAIGVAVGFARDNNGAAALAGTIGYLVLTTVLKTIDKSLDMGVLAGIVAGAVAGGLYNRYRNVALPPYLGFFSGKRFVPIVTALCCLLLGIVLAYAWAPVQAGINAAGAWLTTAGSAGALVFGLLNRLLLVTGLHHLINTLAWFVFGNYADPATGAAVSGDLHRYFAGDPGAGLFMTGFFPVMMFGLPAACLAMYHETPPARRALVGGMLFSMALTSFLTGITEPIEFSFMFLAPVLYGLHALMTGLSMALCHALDIRLGFTFSAGAIDYVLGYGLSSRGWLAIPLGLAYALVYYGLFRFFIRRFNLLTPGRDEVVPVAAAGGAAQPAAGSVAQQYVEALGGPANLVVVDACTTRLRLNVADIGAVSEPRLKALGVRGVLKRPPNVVQVVIGPQAEQVAGDIRAVLQQAPQATAVVAAAPAVATQASVPAAGAFDPAWWIDALGGAANIASV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将野生型的罗尔斯通氏菌基因组中编码N
‑
乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行突变，使其编码的蛋白质的第265位氨基酸由G突变为R，并敲除编码GntR家族的转录调节因子nagR，使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖，其中，所述N
‑
乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的编码基因为nagE编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1的蛋白质，所述GntR家族的转录调节因子nagR的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；(2)异源表达酿酒酵母来源的肌醇
‑3‑
磷酸合酶ScIPS基因，构建突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞，其中，所述酿酒酵母来源的肌醇
‑3‑
磷酸合酶ScIPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.根据权利要求1所述的构建以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：敲除ED途径和/或PHB合成途径中的关键基因，其中，所述ED途径关键基因为葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的编码基因zwf1、zwf2和zwf3，所述葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的编码基因zwf1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述zwf2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述zwf3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述PHB合成途径关键基因为聚([R]
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3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA(H16_A1438)和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1，所述聚([R]
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3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。3.一种以葡萄糖、甘油和CO2为碳源生产肌醇的罗尔斯通氏菌工程菌株，其特征在于，所述工程菌株通过包括以下步骤的方法获得：(1)将野生型的罗尔斯通氏菌基因组中编码N
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乙酰氨基葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的基因nagE进行突变，使其编码的蛋白质的第265位氨基酸由G突变为R，并敲除编码GntR家族的转录调节因子nagR，使罗尔斯通氏菌能够高效利用葡萄糖，其中，所述N
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乙酰氨基葡萄糖特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓璐，张杰，姚斌，罗会颖，黄火清，柏映国，苏小运，涂涛，张红莲，王苑，王亚茹，秦星，于会民，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：