菌体自毁系统的构建方法及应用技术方案

本发明专利技术提供了菌体自毁系统的构建方法及应用。包括如下步骤：将粘质沙雷氏菌的SMnuc l ease基因连上严谨型诱导型启动子；利用载体将含有非限制性核酸酶基因连上严谨型诱导型启动子转入宿主菌株中，进行培养发酵；加入诱导剂，对进宿主细胞继续培养，再对宿主细胞核酸酶消化效果检测。当目标产物发酵完成时，通过添加可诱导P

【技术实现步骤摘要】
菌体自毁系统的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物技术
，具体涉及菌体自毁系统的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]粘质沙雷氏菌的SMnuclease基因表达一个非限制性核酸酶，该酶由分子量为30kDa的两个亚基组成的，其功能非常强大，能消化线性的、环状的、双链的或者单链的各种核酸，而且对核酸的序列没有特定的要求，产物为3～5个核苷酸的寡聚核酸。该酶作用的PH范围为6～10，温度范围是0～42℃，酶发挥活性需要1～2mMMg
2+
。
[0003]启动子是一段位于目标基因转录区上游、能与RNA聚合酶结合从而实现转录起始的DNA序列。启动子按照作用方式分为组成型启动子和诱导型启动子两大类。其中，组成型启动子调控的基因，不需要转录调控因子的参与，在细胞生长过程中即可实现基因的正常转录和翻译表达。而诱导型启动子则需要正调控或者负调控蛋白与诱导物或者光和温度变化等物理信号共同作用，才能启动转录过程的正常进行。目前诱导型启动子在微生物代谢调控中应用更多。
[0004]目前去除发酵产物中基因残留的方法主要有两种，一是用特定的产物纯化方法减少最终产物中的基因残留，但是效果不佳；另一种方法是额外添加核酸酶去除产物中的基因残留，但成本太高。通过基因工程手段，让工业微生物能在特定条件下表达核酸酶，对自身的遗传物质进行消化，将会兼具效果好、成本低的优点。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供菌体自毁系统的构建方法，以解决现有技术中的特定的产物纯化方法减少最终产物中的基因残留效果不佳、成本太高的问题。
[0006]本专利技术其中一个实施例提供了菌体自毁系统的构建方法。
[0007]所述菌体自毁系统的构建方法包括如下步骤：
[0008]步骤1：根据已公布的序列，人工合成启动子P
JExD
，并装配到质粒PMD18
‑
T中，得到质粒PMD18
‑
T
‑
P
JExD
。
[0009]所述启动子P
JExD
如SEQ ID NO.1所示；
[0010]在其中一个实施例中，由于P
JExD
是一个严谨型的诱导型启动子，通常情况下Ei l R阻遏蛋白会结合在该启动子上，下游基因不能表达，当加入碱性染料诱导剂结晶紫后后，碱性染料能和EilR阻遏蛋白结合，导致EilR阻遏蛋白构相发生变化，进而从P
JExD
启动子脱落下来，进而使得非限制性核酸酶基因SMnuclease正常表表达，同时所述P
JExD
启动子具有严谨、能被高效诱导、微生物适用性广、诱导剂廉价等优点，可以控制工业微生物中表达非限制性核酸酶，并对自身的核酸进行消化，清除发酵产物中的基因残留，使得消化效果好、成本低。
[0011]步骤2：利用具有P3和/或P4核苷酸序列的扩增引物，以PMD18
‑
T
‑
P
JExD
为模板进行PCR扩增，得到启动子P
JExD
片段：
[0012]P3:5
’‑
AAAAAACTGCAAAAAATAGTTTGACA
‑3’
；
[0013]P4:5
’‑
TAAAGCGCATAAAGTTGGACACGTGTCCAACT
‑3’
；
[0014]步骤3：利用具有P1和/或P2核苷酸序列的扩增引物，以粘质沙雷氏菌基因组为模板进行PCR扩增得到SMnuclease基因片段：
[0015]P1:5
’‑
GTCCAACTTTATGCGCTTTAACAACAAGATGTT
‑3’
；
[0016]P2:5
’‑
TCAGTTTTTGCAGCCCATCA
‑3’
；
[0017]步骤4：通过重叠PCR将启动子P
JExD
片段和SMnuclease基因片段连在一起，得到P
JExD
‑
SMnuclease片段；
[0018]步骤5：将步骤4中得到的P
JExD
‑
SMnuclease片段通过AT连接法连接到PMD18
‑
T载体上，得到质粒PMD18
‑
T
‑
P
JExD
‑
SMnuclease；
[0019]步骤6：将步骤5中得到的质粒PMD18
‑
T
‑
P
JExD
‑
SMnuclease转化到感受态BL21中进行诱导表达12h，取菌液提质粒并DNA浓度。
[0020]在其中一个实施例中，利用严谨型的诱导型启动子P
JExD
启动粘质沙雷氏菌的非限制性核酸酶基因SMnuclease，使得在非限制性核酸酶基因SMnuclease工业生产的微生物里表达；同时通过诱导剂控制微生物在进行目标产物发酵时SMnuclease基因不表达，当目标产物发酵完成时，通过添加可诱导P
JExD
启动子启动表达的诱导剂，SMnuclease基因开始表达核酸酶，并消化微生物细胞内的核酸，生成3
‑
5个的寡聚核苷酸，从而达到消除基因残留的目的。
[0021]在其中一个实施例中，所述P
JExD
为严谨性诱导型启动子，但不仅限于P
JExD
，所述启动子还包括在宿主菌株里具有严谨型诱导型启动功能的启动子。
[0022]在其中一个实施例中，所述基因组包括但不限于粘质沙雷氏菌基因组，所述基因组还包括能表达具有良好的非限制性核酸酶活性的核酸酶基因。
[0023]在其中一个实施例中，所述P
JExD
为严谨性诱导型启动子，但不仅限于P
JExD
，所述启动子还包括在宿主菌株里具有严谨型诱导型启动功能的启动子，如P
JExL
、P
JExA1
、P
JExA2
、P
JExH1
、P
JExH2
、P3AF等。
[0024]在其中一个实施例中，所述基因包括但不限于粘质沙雷氏菌基因，所述基因还包括能表达具有良好的非限制性核酸酶活性的丝状体蓝藻鱼腥藻非限制性核酸酶基因。
[0025]本专利技术其中一个实施例还提供了菌体自毁系统的构建方法，包括：
[0026]以上实施例所提供的菌体自毁系统的构建方法具有以下有益效果：
[0027]1、在其中一个实施例中，利用严谨型的诱导型启动子P
JExD
启动粘质沙雷氏菌的非限制性核酸酶基因SMnuclease，使得在非限制性核酸酶基因SMnuclease工业生产的微生物里表达；同时通过诱导剂控制微生物在进行目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.菌体自毁系统的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：将粘质沙雷氏菌的SMnuclease基因连上严谨型诱导型启动子；利用载体将含有非限制性核酸酶基因连上严谨型诱导型启动子转入宿主菌株中，进行培养发酵；加入诱导剂，对进宿主细胞继续培养，再对宿主细胞核酸酶消化效果检测。2.如权利要求1所述的菌体自毁系统的构建方法，其特征在于，所述严谨型诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。3.如权利要求1所述的菌体自毁系统的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞中的非限制性核酸酶基因的表达水平是通过对所述非限制性核酸酶基因连上所述严谨型诱导型启动子再加入诱导剂诱导核酸酶表达实现。4.如权利要求3所述的菌体自毁系统的构建方法，其特征在于，其中所述非限制性核酸酶基因为粘质沙雷氏菌的非限制性核酸酶基因SMnuclease核酸酶基因。5.如权利要求4所述的菌体自毁系统的构建方法，其特征在于，所述SMnuclease核酸酶基因序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。6.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡友华，吴子豪，林钰宽，谢学敏，陈允妲，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：