一种用于支原体检测的电化学生物传感器及检测支原体方法技术

本发明专利技术公开了一种用于支原体检测的电化学生物传感器及检测支原体方法，所述电化学生物传感器包括纳米棒电极，所述纳米棒电极的表面连接有核酸序列如SEQIDNO.1所示的第一序列。通过捕捉待检测支原体ssDNA，随后结合含有金纳米星

【技术实现步骤摘要】
一种用于支原体检测的电化学生物传感器及检测支原体方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种用于支原体检测的电化学生物传感器及检测支原体方法。

技术介绍

[0002]支原体(Mycoplasma)是一种常见病原菌，可广泛感染人体的多个器官与组织并引发病变，严重危害人民生命健康。其中，我国肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)感染发病率高，约占呼吸道感染的16.7
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40.6％，且儿童是出现肺炎支原体感染的主要群体，重症时可出现呼吸困难，甚至引起灶性肺不张、肺实变及肺气肿，对儿童的发育及生命健康均有极大的威胁。然而，肺炎支原体感染存在缺乏特异性临床表现、影像学表现复杂多样等情况，致使其早期快速诊断困难，进一步增加其初始治疗失败风险及后续治疗难度。此外，支原体感染还广泛存在于其他疾病的发生发展中，例如解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，UU)、人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)和生殖支原体(Mycoplasma genitalium，MG)是引起人体泌尿生殖道感染的常见病原体，我国泌尿生殖道感染中支原体感染率为11.58
‑
31.1％。泌尿生殖道支原体感染主要与非淋菌性尿道炎、宫颈炎、盆腔炎、前列腺炎、附睾炎等疾病相关，可通过胎盘或产道等途径导致早产、先天畸形、死胎、不孕症以及新生儿肺炎或脑膜炎等疾病的发生。然而以往传统的单一病原菌检测，对泌尿生殖道支原体感染诊断价值不高，极易出现漏诊、误诊情况等情况的出现，致使病情延误。
[0003]另一方面，细胞培养是现代生物科学中基础科学研究和药物研究中的一项重要实验技术。据调查，实验室中30％
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60％的细胞株均被支原体污染过，特别是传代细胞的培养过程中，支原体污染更是常见。支原体污染可引起细胞生长速度、染色体畸变、核酸和氨基酸的合成与代谢、膜结构改变、细胞凋亡等，最后引起细胞表达的变化从而影响科研结果。因此，实验室支原体污染的特异性检测及有效预防至关重要。
[0004]目前基础与临床上常用的支原体感染检测方法主要包括分离培养法、DNA检测法、PCR检测法、酶学检测、ELISA与宏基因组测序等。其中，分离培养法是支原体检测的金标准，但由于该方法培养要求高、耗时较长，且存在高假阳性和污染率的风险，在临床实际实施过程难度较大，难以充分满足目前的临床需求。因此临床上常采用血清特异性抗体检测肺炎支原体，并以肺炎支原体IgM抗体(MP
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IgM)阳性转化或抗体滴度上升4倍以上标定为肺炎支原体感染。然而MP
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IgM检测具有一定的滞后性，一般需要在发病1周后才可检测，且假阴性率较高，因此难以实现对支原体肺炎的实时早期诊断。
[0005]此外，由于解脲支原体、人型支原体分离培养极为困难，敏感性低，成功培养需数周时间，对培养设备和环境要求高，因此培养法难以作为解脲支原体的常规诊断方法。解脲支原体、人型支原体主要使用核酸恒温扩增实时荧光检测技术(Simultaneous amplification and testing，SAT)，此技术具有高特异性与灵敏度，但对检测仪器具有较高要求，难以实现基层医疗卫生机构的全面普及和快速筛查。因此如何建立快速、灵敏的支原体感染早期检测方法是目前医学临床诊断研究以及基础科学实验中的迫切问题之一。
[0006]电化学生物传感器可以识别电极上的特定生物分子，并通过电子转导将生物分子的存在转化为可测量的信号。相对于传统检测方法，电化学生物传感器由于其灵敏度高、专一性好、响应速度快与设备可小型化等优势而逐渐被广泛应用于基础研究中。针对肺炎支原体、解脲支原体与人型支原体等感染疾病早期诊断的临床需求与细胞支原体污染早期检测的基础科学实验要求，亟需开发一种新的电化学生物传感器实现对多种支原体的快速、高灵敏度的检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提出一种用于支原体检测的电化学生物传感器，能够快速、准确、高效、便捷地同步检测样本中的多种支原体。
[0008]本专利技术还提出一种使用上述电化学生物传感器进行支原体检测的方法。
[0009]根据本专利技术的一个方面，提出了一种用于支原体检测的电化学生物传感器，包括：具有中空结构的纳米棒电极，所述纳米棒电极的表面连接有核酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一序列。
[0010]所述第一序列是用于多种支原体检测的通用基因片段(Universal Gene fragment，UGF)，通过针对至少包括肺炎支原体、猪鼻支原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体在内的支原体的16S rRNA基因对比，得到适用于这些支原体检测的通用基因片段序列。
[0011]所述第一序列(SEQ ID NO.1)具体为：5
’‑3’
TGGTG CATGG TTGTC GTCAG CTCGT GTCGT GAGAT GTT。
[0012]在本专利技术中，所述电化学生物传感器用于构建三明治杂交法，通过碱基互补配对实现首次多种支原体无差别捕捉，末次不同支原体特异性识别，定量检测一种/多种支原体DNA的含量。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述纳米棒电极为中空结构，所述纳米棒电极具有中空导电高分子材料，通过所述中空导电高分子材料与所述第一序列连接。所述纳米棒的中空结构从内到外依次为：金电极、中空层和中空导电高分子材料。
[0014]在本专利技术实施方式中的中空导电高分子材料为导电共轭聚合物结构，采用其导电共轭聚合物结构中的S
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H或N
‑
H键有助于电子的吸附，且碳碳单键和碳碳双键交替排列成的共轭结构，共轭双键中的2个π电子并没有固定在某个碳原子上，使其可以从一个碳原子转位到另一个碳原子上。即分子内的π电子云的重叠产生了整个分子共有的能带，π电子类似于金属导体中的自由电子，在整个分子链上延伸。当有电场存在时，组成π键的电子可以沿着分子链移动有效提升响应速度和灵敏度。
[0015]在本专利技术一些优选的实施方式中，所述中空导电高分子材料包括聚(吡咯
‑3‑
羧酸)、聚(吡咯
‑2‑
羧酸)、聚三噻吩乙酸和聚(3，4
‑
乙烯二氧噻吩)中的至少一种。
[0016]在本专利技术一些优选的实施方式中，所述中空导电高分子纳米棒的尺寸直径为50nm左右，长度约为1μm。中空导电高分子纳米棒，有效增加转换界面比表面积和活性位点，提升电化学传感器的响应速率。且结构有效限制核酸序列排列方向，增加支原体靶序列的有效捕捉率，提高传感器的特异性。
[0017]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述纳米棒电极通过以下方法制备得到：金电极在氧化锌溶液中通过计时电位法制备得到氧化锌纳米棒；所述氧化锌纳米棒通过循环伏安法聚合沉积导电高分子得到高分子纳米棒修饰的电极；将所述高分子纳米棒修饰的电极置于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于支原体检测的电化学生物传感器，包括：纳米棒电极，所述纳米棒电极的表面连接有核酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一序列。2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述纳米棒电极具有中空导电高分子材料，通过所述中空导电高分子材料与所述第一序列连接。3.如权利要求2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述纳米棒电极通过以下方法制备得到：金电极在氧化锌溶液中通过计时电位法制备得到氧化锌纳米棒；所述氧化锌纳米棒通过循环伏安法聚合沉积导电高分子得到高分子纳米棒修饰的电极；将所述高分子纳米棒修饰的电极置于盐酸中移除氧化锌模板得到中空导电高分子修饰电极；将所述中空导电高分子修饰电极表面的羧基激活后通过酰胺反应与所述第一序列连接，得到最终的所述纳米棒电极。4.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器还包括等离子体金纳米星材料，所述等离子体金纳米星材料连接有电化学指示剂和第二序列。5.如权利要求4所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学指示剂包括二茂铁、亚甲基蓝、蒽醌、甲基紫精和尼罗蓝中的至少一种。6.如权利要求4所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述第二序列为针对支原体设计产物的特异性引物；所述特异性引物的核酸序列包括i～v中的至少一组：i、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；ii、SEQ ID NO.4和SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦洁玲，王蕴，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：