一种电化学外泌体适体传感器及其构建和使用方法技术

本方案公开了生物传感器技术领域的一种电化学外泌体适体传感器，包括@PdCuB MNS纳米标签和Au@CuCl2NWs适体电极，所述Au@CuCl2NWs修饰电极上有捕获外泌体的CD63适体，所述@PdCuB MNS纳米标签为外泌体特征蛋白适体修饰的PdCuB MNSs介孔纳米酶。本发明专利技术将PdCuB MNSs制备成一种优异的纳米信号标签，对H2O2表现出过类氧化物样活性。结合导电性能好的Au@CuCl2NWs，通过改变PdCuB MNSs纳米信标上检测适体的序列，用于检测临床样本中的外泌体。因此，研制的电化学外泌体适体传感器为临床诊断提供了一个通用的外泌体分析平台。提供了一个通用的外泌体分析平台。提供了一个通用的外泌体分析平台。

【技术实现步骤摘要】
一种电化学外泌体适体传感器及其构建和使用方法


[0001]本专利技术属于生物传感器
，特别涉及一种电化学外泌体适体传感器及其构建和使用方法。

技术介绍

[0002]癌症是一个重要的全球公共卫生问题，在全球死亡率中占比较高。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)是全球所有主要癌症类型中最致命的一种，约占所有肺癌的85％。在临床上，由于早期诊断困难，非小细胞肺癌患者的中位生存率和五年生存率历来较低。组织活检是诊断非小细胞肺癌的金标准；然而，由于侵入性采样的危险性、技术要求的复杂性以及劳动力的密集性，使得组织活检已不再适合早期筛查。
[0003]外泌体(直径30
‑
150nm)存在于体液(如唾液、血清、尿液和眼泪)中，具有良好的稳定性。癌症衍生的外泌体由各种分子内容物组成，它们在重塑远处微环境(包括转移前微环境)和驱动器官特异性转移的细胞间通信中起着至关重要的作用。最近研究表明，癌症衍生的外泌体富含相应的特征性表面蛋白。例如，Zhang的研究小组发现程序性死亡配体1(PD
‑
L1)蛋白在NSCLC患者的外泌体的膜表面上高表达，这表明具有PD
‑
L1蛋白的外泌体有希望成为早期检测NSCLC的关键生物标志物。因此发展一种可以有效检测癌源性PD
‑
L1外泌体的方法对非小细胞肺癌具有重要的诊断和治疗意义。得益于适体
‑
受体相互作用的天然强亲和力，新型夹心电化学策略对于外泌体的检测具有优异的选择性和特异性，临床上，电化学生物传感器通常被生物酶集成为信标来产生电化学信号，但其稳定性不好，寿命有限。

技术实现思路

[0004]本专利技术意在解决现有技术中存在的问题，提供一种电化学外泌体适体传感器及其构建和使用方法。
[0005]本方案中的一种电化学外泌体适体传感器，包括@PdCuB MNS纳米标签和Au@CuCl
2 NWs适体电极，所述Au@CuCl
2 NWs修饰电极上有捕获外泌体的CD63，所述@PdCuB MNS纳米标签为外泌体特征蛋白适体修饰的PdCuB MNSs介孔纳米酶。
[0006]所述CD63适体是一种可以与外泌体表面蛋白结合的DNA序列，CD63蛋白在所有外泌体表面都有表达。
[0007]本专利技术还提供了所述电化学外泌体适体传感器的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)合成PdCuB MNSs介孔纳米酶：
[0009]称取DODAC分散到去离子水中，超声、搅拌后，依次加入NH4F溶液、H3BO3溶液、H2PdCl4溶液和CuNO3溶液，并于搅拌下缓慢加入NH3·
H2O，待混合溶液的颜色变为浅白色后继续孵育至反应完全后注入新制备的DMAB溶液，然后离心获得产物，洗涤数次；
[0010](2)合成@PdCuB MNS纳米标签：
[0011]将制备的PdCuB MNSs介孔纳米酶添加到含有外泌体特征蛋白适体的PBS中，室温下孵化后丢弃未结合的外泌体特征蛋白适体，收集外泌体特征蛋白适体修饰的PdCuB MNSs
介孔纳米酶，既得@PdCuB MNS纳米标签；
[0012](3)合成CuCl
2 NWs
[0013]制备CuCl2和硫脲的醇溶液，反应至溶液中有白色悬浮液形成，离心、收集产物并洗涤；
[0014](4)合成Au@CuCl
2 NWs
[0015]制备AuCl3的醇溶液，加入所述CuCl
2 NWs进行混合得到悬浮液，离心、重复洗涤获得Au@CuCl
2 NWs；
[0016](5)制备Au@CuCl
2 NWs适体电极
[0017]抛光且干燥的裸玻碳电极上滴入Au@CuCl
2 NWs悬浮液，干燥后，将CD63适体滴在所述玻碳电极上进行孵育，既得所述Au@CuCl
2 NWs适体电极。
[0018]构建的Au@CuCl
2 NWs适体电极储存在4℃下直到使用。
[0019]进一步，所述裸玻碳电极采用氧化铝悬浮液抛光，然后在超声波浴中用超纯水冲洗，在氮气下干燥。
[0020]进一步，所述(5)中，CD63适体在玻碳电极上孵育的温度为4℃。
[0021]本专利技术提供来所述电化学外泌体适体传感器的使用方法，包括以下步骤：
[0022](1)将含外泌体的体液滴在所述Au@CuCl
2 NWs适体电极表面孵育一定时间；
[0023](2)再将@PdCuB MNS纳米标签分散于PBS中，滴加到(1)中的Au@CuCl
2 NWs适体电极上，再次孵育一定时间；
[0024](3)将完成(2)后的Au@CuCl
2 NWs适体电极浸入含有H2O2的PBS缓冲液中，在0.15至
‑
0.65V的电位扫描电压下，用电化学工作站测量差分脉冲伏安法进行信号输出。
[0025]进一步，所述孵化时间为1h。
[0026]进一步，所述使用方法中每一步结束后都用PBS缓冲液洗掉多余的未结合物质。
[0027]本专利技术的工作原理及效果是:本专利技术首次发现Au@CuCl
2 NWs具有良好的导电性，将Au@CuCl
2 NWs组装为所述电化学外泌体适体传感器的衬底平台，并且将用于捕获外泌体的CD63适体固定在Au@CuCl
2 NWs适体电极上，有助于可提所述传感器的检测灵敏度。在实验中，本专利技术得到的@PdCuB MNS纳米标签，具有出色的类过氧化物酶作用，用于催化过氧化氢(H2O2)以生成电化学报告信号。
[0028]本专利技术进行的验证结果表明，采用PD
‑
L1适体修饰PdCuB MNS介孔纳米酶得到的PD
‑
L1适体@PdCuB MNS纳米标签可鉴定特异性NSCLC衍生的外泌体。在NSCLC衍生的外泌体存在下，CD63适体和PD
‑
L1适体形成夹心结构，这使PD
‑
L1适体@PdCuB MNS纳米标签能够组装到Au@CuCl
2 NWs修饰电极的表面上。
[0029]基于相同的原理，通过改变PdCuB MNSs纳米信号标签上检测适体的序列，适体传感器可以用于检测其他外泌体。因此，研制的电化学适体传感器为临床诊断提供了一个通用的外泌体分析平台。利用PdCuB MNSs和Au@CuCl
2 NWs的电化学性能优势，所开发的电化学外泌体适体传感器显示出优越的检测灵敏度，是一种有前景的外泌体检测技术。
附图说明
[0030]图1为使用本专利技术电化学外泌体适体传感器的制备流程及检测原理的示意图；
[0031]图2来源于A549细胞外泌体(PD
‑
L1外泌体)的表征；(A)分离外泌体的TEM图像(比
例尺：50nm)(B)分离外泌体的NTA；
[0032]图3为PdCuB MNSs介孔纳米酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学外泌体适体传感器，其特征在于，包括：包括@PdCuB MNS纳米标签和Au@CuCl
2 NWs适体电极，所述Au@CuCl
2 NWs修饰电极上有捕获外泌体的CD63适体，所述@PdCuB MNS纳米标签为外泌体特征蛋白适体修饰的PdCuB MNSs介孔纳米酶。2.根据权利要求1所述的一种电化学外泌体适体传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成PdCuB MNSs介孔纳米酶：称取DODAC分散到去离子水中，超声、搅拌后，依次加入NH4F溶液、H3BO3溶液、H2PdCl4溶液和CuNO3溶液，并于搅拌下缓慢加入NH3·
H2O，待混合溶液的颜色变为浅白色后继续孵育至反应完全后注入新制备的DMAB溶液，然后离心获得产物，洗涤数次；(2)合成@PdCuBMNS纳米标签：将制备的PdCuB MNSs介孔纳米酶添加到含有外泌体特征蛋白适体的PBS中，室温下孵化后丢弃未结合的外泌体特征蛋白适体，收集外泌体特征蛋白适体修饰的PdCuB MNSs介孔纳米酶，既得@PdCuBMNS纳米标签；(3)合成CuCl
2 NWs制备CuCl2和硫脲的醇溶液，反应至溶液中有白色悬浮液形成，离心、收集产物并洗涤；(4)合成Au@CuCl
2 NWs制备AuCl3的醇溶液，加入所述CuCl
2 NWs进行混合得到悬浮液，离心、重复洗涤获得Au@CuCl
2 NWs；(5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长金，闵维子阳，丁世家，赵辉，周文燕，许大林，
申请(专利权)人：重庆市第五人民医院，
类型：发明
国别省市：