无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法、构建结构及应用技术

本发明专利技术公开了无酶、免标记的高效DNA逻辑门的构建方法、构建结构及应用，包括构建无酶、免标记的DNA传感体系，构建AND,OR及NOR型DNA逻辑门；构建电化学传感界面，用于miRNA和甲基化DNA的多个逻辑门检测。本发明专利技术中无酶、免标记的高效DNA逻辑门，利用toehold介导的DNA链置换反应实现miRNA和甲基化DNA的精准识别，并通过原位合成银纳米簇催化还原H2O2，构建了AND，OR及NOR型逻辑门电化学传感平台，对相关疾病的早期诊断具有重要的指导意义和应用价值。的早期诊断具有重要的指导意义和应用价值。的早期诊断具有重要的指导意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法、构建结构及应用


[0001]本专利技术涉及电化学生物传感器领域，具体涉及无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法、构建结构及应用。

技术介绍

[0002]近年来，逻辑运算在分子计算、智能诊断和多重传感检测等研究方向得到了科学研究工作者的广泛关注。鉴于DNA具有优异的序列可控性、识别能力和易于编程的特点，DNA适合作为构建逻辑门的基础材料，在分子计算、纳米机器构建、标志物检测以及疾病诊断等领域应用广泛，DNA逻辑门及其运算的发展潜力和未来的应用前景也逐步凸显出来。现有的DNA逻辑门主要是基于蛋白酶作用或DNA瓦片技术进行计算，但这些方法存在需要共价标记信号分子、设计复杂和操作繁琐的缺点，因此亟需研发一种无酶、免标记的DNA逻辑门。
[0003]金属纳米簇，以金、银、铜、铂纳米簇(Au,Ag,Cu,Pt NCs)为代表，具有优良的光学、催化、手性、磁性、电化学等性质。其中，银纳米簇(AgNCs)拥有良好的导电性、催化性能和生物相容性，因而被广泛应用于生物医学、化学化工和分析传感等领域。银纳米簇对过氧化氢具有很好的催化效应，其性能在很大程度上取决于材料的结构、尺寸和分散性等因素，因此制备方法对银纳米簇的催化性能至关重要。研究表明，胞嘧啶碱基可以选择性与银离子结合，进而可以利用富含胞嘧啶的DNA链作为模板，合成稳定性和分散性良好的银纳米簇。因此，在传感界面上以DNA为模板原位合成银纳米簇，并进行过氧化氢的催化检测，可以避免复杂的信号标记过程，并且提高检测的灵敏度。此外，toehold介导的链置换反应是在两条完全互补或部分互补的DNA链杂交的基础上，以未配对区(toehold)作为支点，通过熵驱动置换掉先前杂交的一条或多条DNA链的反应，该反应具有较高的特异性，且无需任何酶的参与，从而降低检测成本，并进一步提高传感器的性能。因此，利用toehold介导的链置换反应实现精准识别，结合纳米簇的原位合成放大检测信号，有望构建无酶、免标记的高效DNA逻辑门。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法、构建结构及应用，利用toehold介导的链置换反应实现精准识别，结合纳米簇的原位合成放大检测信号，实现miRNA 122和甲基化DNA的传感分析。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法，其创新点在于：所述无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法包括以下步骤：
[0006]步骤S1：首先将固定探针IP1、固定探针IP2和辅助探针AP混合，混合后退火杂交处理得到V型复合探针VP；
[0007]其中，所述固定探针IP1的序列为5
′‑
(CH2)6‑
SH
‑
TTTTTTCAATGGTGTTTG
‑3′
，所述固定探针IP2的序列为5
′‑
GGTGACAAGCGACGAAGCAGTTTTTT
‑
(CH2)6‑
SH
‑3′
，所述辅助探针AP的序列为5
′‑
CAAACACCATTGTTTTCTGCTTCGTCGCTTGTCACCACCTA
‑3′
；
[0008]步骤S2：进行金电极的预处理，接着将所述V型复合探针VP固定到已经预处理后的金电极表面，并用巯基己醇MCH进行封闭得到MCH/VP/AuE，所述MCH/VP/AuE作为DNA逻辑门的传感基底；
[0009]步骤S3：将miRNA、甲基化DNA与连接探针LP进行杂交，之后滴加至步骤S2得到的MCH/VP/AuE界面反应；
[0010]其中，所述miRNA 122的序列为5
′‑
UCAUCGGAGCUCACACUCCA
‑3′
，所述甲基化DNA的序列为5
′‑
TAGGTGGTGACAAGCGACGAAGCAGGCTCCGATGA
‑3′
，所述连接探针LP的序列为TCATCGGAGCTCACACTCCA；
[0011]步骤S4：在步骤S3界面反应完成后加入信号探针SP杂交，杂交完成后加入100μM硝酸银孵育，孵育后冲洗，冲洗完成后滴入500μM硼氢化钠原位合成银纳米簇；
[0012]其中，所述信号探针SP的序列为5
′‑
CAAACACCATTGCCCCCCCCCCCC
‑3′
。
[0013]优选的，所述步骤S1中固定探针IP1、固定探针IP2和辅助探针AP混合比例为1:1:1。
[0014]优选的，所述步骤S1中退火杂交处理为，固定探针IP1、固定探针IP2和辅助探针AP混合后采用95℃加热10分钟，接着以1℃/分钟的速度降温至25℃。
[0015]优选的，所述步骤S2中金电极的预处理为，首先将金电极置于piranha溶液浸泡半个小时，并用氧化铝粉末打磨，并依次在蒸馏水和乙醇中超声处理；接着将金电极置于0.5M H2SO4溶液中在
‑
0.3至1.55V范围内进行电化学扫描，直至得到稳定的循环伏安曲线；接着将V型复合探针VP与三(2
‑
羧乙基)膦反应60分钟以打开双硫键，随后滴加到处理好的AuE表面，在避光条件下孵育12小时，冲洗过后再将巯基己醇MCH滴加到传感界面上封闭2小时，得到MCH/VP/AuE。
[0016]优选的，所述piranha溶液为浓硫酸和双氧水的混合物，其中浓硫酸为98％H2SO4，双氧水为30％H2O2，且浓硫酸和双氧水的体积比为3:1。
[0017]优选的，所述氧化铝粉末打磨为至少两次打磨，包括一次粗抛和二次精抛，一次粗抛采用直径为0.3μm的氧化铝粉末打磨，二次精抛采用0.05μm的氧化铝粉末打磨。
[0018]优选的，所述步骤S3中将miRNA 122、甲基化DNA与连接探针LP在室温下进行杂交2小时，随后滴加到电极表面与MCH/VP/AuE反应90分钟。
[0019]优选的，所述步骤S4中将信号探针SP滴加到电极表面杂交反应60分钟，接着加入100μM硝酸银孵育半小时，冲洗过后再将500μM硼氢化钠滴加到传感界面上反应5分钟。
[0020]无酶、免标记的DNA逻辑门的构建结构，应用所述的无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法，所述无酶、免标记的DNA逻辑门的构建结构为采用无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法得到的DNA逻辑门。
[0021]无酶、免标记的DNA逻辑门的应用，采用所述的无酶、免标记的DNA逻辑门的构建结构，所述无酶、免标记的DNA逻辑门的应用为所述DNA逻辑门在miRNA122和甲基化DNA传感方面的应用。
[0022]本专利技术的优点在于：与现有技术相比，本专利技术利用toehold介导的链置换反应实现精准识别，结合纳米簇的原位合成催化过氧化氢还原，实现miRNA 122和甲基化DNA的多种逻辑门传感分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法，其特征在于：所述无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法包括以下步骤：步骤S1：首先将固定探针IP1、固定探针IP2和辅助探针AP混合，混合后退火杂交处理得到V型复合探针VP；其中，所述固定探针IP1的序列为5
′‑
(CH2)6‑
SH
‑
TTTTTTCAATGGTGTTTG
‑3′
，所述固定探针IP2的序列为5
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GGTGACAAGCGACGAAGCAGTTTTTT
‑
(CH2)6‑
SH
‑3′
，所述辅助探针AP的序列为5
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CAAACACCATTGTTTTCTGCTTCGTCGCTTGTCACCACCTA
‑3′
；步骤S2：进行金电极的预处理，接着将所述V型复合探针VP固定到已经预处理后的金电极表面，并用巯基己醇MCH进行封闭得到MCH/VP/AuE，所述MCH/VP/AuE作为DNA逻辑门的传感基底；步骤S3：将miRNA、甲基化DNA与连接探针LP进行杂交，之后滴加至步骤S2得到的MCH/VP/AuE界面反应；其中，所述miRNA 122的序列为5
′‑
UCAUCGGAGCUCACACUCCA
‑3′
，所述甲基化DNA的序列为5
′‑
TAGGTGGTGACAAGCGACGAAGCAGGCTCCGATGA
‑3′
，所述连接探针LP的序列为TCATCGGAGCTCACACTCCA；步骤S4：在步骤S3界面反应完成后加入信号探针SP杂交，杂交完成后加入100μM硝酸银孵育，孵育后冲洗，冲洗完成后滴入500μM硼氢化钠原位合成银纳米簇；其中，所述信号探针SP的序列为5
′‑
CAAACACCATTGCCCCCCCCCCCC
‑3′
。2.如权利要求1所述的无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中固定探针IP1、固定探针IP2和辅助探针AP混合比例为1:1:1。3.如权利要求1所述的无酶、免标记的DNA逻辑门的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中退火杂交处...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颇，沈慧，豆保婷，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：