一种电化学生物传感器、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种电化学生物传感器，包括：带电极捕捉界面的工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液；带电极捕捉界面的工作电极为负载有壳聚糖

【技术实现步骤摘要】
一种电化学生物传感器、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于草酸含量测定
，尤其涉及一种用于草酸含量测定的电化学生物传感器及制备方法。

技术介绍

[0002]近年来，在纸浆和造纸工业中,由于使用臭氧、二氧化氯、氧气和过氧化氢等强氧化剂进行漂白的过程中会形成高浓度的草酸盐，因此纸浆和造纸工业中对草酸的测量和控制的要求也越来越高；因为草酸很容易以草酸钙晶体的形式沉淀，这会导致管道、洗涤过滤器和热交换器发生堵塞；草酸以钙盐和镁盐的形式广泛分布在植物细胞和细胞壁中，人体摄入这些高草酸的植物食物后，会产生草酸钙沉淀，可能形成肾结石；因此，在原发性高草酸尿症的诊断治疗、尿结石的防治研究、高草酸尿症患者的低草酸盐食品加工和啤酒生产等方面，尤其是临床诊断中，草酸的测定具有重要意义；目前，有大量不同的草酸盐测定方法可供使用，例如高效液相色谱法、基于草酸氧化酶的分光光度法或草酸脱羧酶和化学发光检测法；最常用的草酸含量测定方法为比色法，但比色法需要对样品进行分离，且显色前后需要加热分离后的样品数十分钟，步骤多，费时间；现有的草酸盐测定方法具备高灵敏度和特异性，但也有设备和分析成本高、消耗时间长和操作繁琐等缺点。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种电化学生物传感器、制备方法及应用。
[0004]这种电化学生物传感器，为草酸脱羧酶生物传感器，包括：带电极捕捉界面的工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液；带电极捕捉界面的工作电极为负载有壳聚糖
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多壁碳纳米管复合薄膜、草酸脱羧酶和电子媒介体，且通过戊二醛进行固定后的工作电极；草酸脱羧酶从菌株Bacillus mojavensis XH1中提取得到，为以5
’
utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5
’
utr oxdc。
[0005]作为优选，参比电极为饱和Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，电解质溶液为PBS缓冲溶液；工作电极为玻碳电极。
[0006]作为优选，电子媒介体为1
’
1二甲基二茂铁。
[0007]这种电化学生物传感器的制备方法，具体包括如下步骤：步骤1、对工作电极进行预处理，采用壳聚糖粉、多壁碳纳米管、以5
’
utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5
’
utr oxdc和1
’
1二甲基二茂铁制备工作电极的电极捕捉界面；步骤2、将环状糊精加入到戊二醛溶液中，静置一段时间，待环状糊精与戊二醛充分发生羟醛缩合反应后，取上层清液得到β
‑
CD
‑
GA 溶液；步骤3、向经步骤1制备得到电极捕捉界面的工作电极表面滴加β
‑
CD
‑
GA 溶液，待
溶液干燥后，得到固定后带电极捕捉界面的工作电极；采用Ag/AgCl电极作为参比电极，采用铂电极作为对电极，采用PBS缓冲溶液作为电解质溶液，与固定后的带电极捕捉界面的工作电极共同组成草酸脱羧酶生物传感器。
[0008]作为优选，步骤1具体包括以下步骤：步骤1.1、对工作电极进行预处理；步骤1.2、将壳聚糖粉溶解于醋酸钠溶液中，制得壳聚糖溶液；将多壁碳纳米管加入到乙醇溶液中，超声分散直至分散均匀，得到多壁碳纳米管溶液；将壳聚糖溶液和多壁碳纳米管溶液按体积比混合形成悬浮液，制备得到壳聚糖
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多壁碳纳米管混合溶液；步骤1.3、从菌株BacillusmojavensisXH1中提取得到草酸脱羧酶；用pET28质粒做载体，在BL21中对草酸脱羧酶进行原核异源表达，得到菌株BL21/pET28
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oxdc（大肠埃希氏菌（Escherichiacoli），2022年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：25643），然后从菌株BL21/pET28
‑
oxdc的5
’
utr序列出发，使用人工合成的5
’
utr序列来调控蛋白的翻译起始速率得到以5
’
utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5
’
utroxdc；步骤1.4、将以5
’
utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5
’
utroxdc掺杂到壳聚糖
‑
多壁碳纳米管混合溶液中，将掺杂有草酸脱羧酶的壳聚糖
‑
多壁碳纳米管混合溶液滴加到工作电极表面，静置至溶液干燥；步骤1.5、称取1
’
1二甲基二茂铁加入乙醇溶液中，超声直到1,1'二甲基二茂铁完全溶解于乙醇中，得到1,1'
‑
DmFc溶液；将1,1'
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DmFc溶液滴加到经步骤1.2处理后的工作电极表面，待溶液干燥后，得到工作电极的电极捕捉界面。
[0009]这种电化学生物传感器的应用方法，将草酸脱羧酶生物传感器用于检测草酸：将草酸脱羧酶生物传感器浸入不同浓度的草酸样品液中，通过GAMRYReference600+电化学工作站，在含有PBS缓冲溶液的电解质溶液中记录和检测电化学生物传感器中的电化学信号变化，根据草酸溶液浓度与电化学信号的对应关系得到草酸的检测结果。
[0010]作为优选，电化学信号为微分脉冲伏安法DPV峰值电流，草酸溶液浓度与微分脉冲伏安法DPV峰值电流的对应关系为线性关系曲线：y=0.03x+0.0283上式中，y为不同浓度草酸对应的微分脉冲伏安法DPV峰值电流，单位为A；x为草酸的浓度，单位为mmol/l。
[0011]作为优选，草酸溶液浓度的范围为0～5mM,每次检测电化学生物传感器中的电化学信号变化的时间为0.5～5秒。
[0012]本专利技术的有益效果是：本专利技术的电化学生物传感器为草酸脱羧酶生物传感器（CNTs/1,1
‘‑
DmFc/β
‑
CD
‑
GA/5
’
utrOxdc），通过对传感器核心元件酶进行改造，采用多壁碳纳米管和壳聚糖复合膜负载草酸脱羧酶和二甲基二茂铁作为捕捉界面，解决了草酸脱羧酶生物传感器的研制过程中，酶的负载基质影响传感电极界面的电子传输效率、酶的活性低且无法实现较大目标物检测等问题；实现酶高活性、高负载的同时，提高电极界面的电子传输效率；本专利技术的电化学生物传感器应用于草酸检测时，检测范围为0～5mM，每次测定的总分析时间为0.5～5秒，进一步推动电化学生物传感器对于草酸的临床检测研究和应用；
本专利技术结合了生物传感和电化学分析技术的分析模式，通过酶促反应实现目标物电化学检测，酶具有专一性、高效性、高灵敏度和反应条件温和等优点；解决了现有的电化学生物传感器对于草酸检测灵敏度较低、检测限较高和难以满足临床要求的问题，实现了草酸的高灵敏性、高选择性、高特异性检测，对于原发性高草酸尿症患者的早期诊断和预后评估提供了一条新途径；与其他检测方法相比，本专利技术的草酸脱羧酶生物传感器检测草酸，具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学生物传感器，其特征在于，为草酸脱羧酶生物传感器，包括：带电极捕捉界面的工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液；带电极捕捉界面的工作电极为负载有壳聚糖
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多壁碳纳米管复合薄膜、草酸脱羧酶和电子媒介体，且通过戊二醛进行固定后的工作电极；草酸脱羧酶从菌株Bacillus mojavensis XH1中提取得到，为以5
’
utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5
’
utr oxdc。2.根据权利要求1所述电化学生物传感器，其特征在于：参比电极为饱和Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，电解质溶液为PBS缓冲溶液；工作电极为玻碳电极。3.根据权利要求2所述电化学生物传感器，其特征在于：电子媒介体为1
’
1二甲基二茂铁。4.一种如权利要求3所述电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤1、对工作电极进行预处理，采用壳聚糖粉、多壁碳纳米管、以5
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utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5
’
utr oxdc和1
’
1二甲基二茂铁制备工作电极的电极捕捉界面；步骤2、将环状糊精加入到戊二醛溶液中，静置一段时间，待环状糊精与戊二醛充分发生羟醛缩合反应后，取上层清液得到β
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CD
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GA 溶液；步骤3、向经步骤1制备得到电极捕捉界面的工作电极表面滴加β
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CD
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GA 溶液，待溶液干燥后，得到固定后带电极捕捉界面的工作电极；采用Ag/AgCl电极作为参比电极，采用铂电极作为对电极，采用PBS缓冲溶液作为电解质溶液，与固定后的带电极捕捉界面的工作电极共同组成草酸脱羧酶生物传感器。5.根据权利要求4所述电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤1具体包括以下步骤：步骤1.1、对工作电极进行预处理；步骤1.2、将壳聚糖粉溶解于醋酸钠溶液中，制得壳聚糖溶液；将多壁碳纳米管加入到乙醇溶液中，超声分散直至分散均匀，得到多壁碳纳米管溶液；将壳聚糖溶液和多壁碳纳米管溶液按体积比混合形成悬浮液，制备得到壳聚糖
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多壁碳纳米管混合溶液；步骤1.3、从菌株Ba...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯宁，李大鹏，路珈，宋秋颖，李先玥，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：