一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法及其应用，涉及食用菌技术领域。本发明专利技术提供了一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法，通过采用在铺有玻璃纸的平板上培养菌丝的方法制备了茶树菇原生质体，与常用的液体培养的菌丝制备原生质体的方法相比具有制备时间短、操作简单和不易污染的优点。同时，本发明专利技术所述方法能够筛选得到更适于生产上用种的茶树菇菌株，筛选出恢复或者超过出发菌株原有性状的再生菌株，具有良好的应用前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及食用菌
，具体涉及一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法及其应用。

技术介绍

[0002]茶树菇Cyclocybe aegerita隶属于真菌界Fungi Kingdom、担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、伞菌亚纲Agaricomycetidae、伞菌目Agaricales、假脐菇科Tubariaceae、环伞属Cyclocybe，分布于中国的江西、福建、云南、浙江及四川等地，因其生长宿主的多样性及形态上的细微差别，茶树菇中文名又被称为杨树菇、柳松茸、柳环菌。茶树菇的营养成分丰富且高蛋白、低脂肪、低糖分，因此茶树菇是集营养、保健和食疗于一身的珍稀食用菌。
[0003]茶树菇菌种作为茶树菇栽培的基础生产资料，对产量和质量起着关键性作用。目前茶树菇种植方面由于长期不良的栽培环境条件，杂菌感染，缺乏人工选择，以及不当的保存菌种的条件都会造成茶树菇优良品种遗传性变劣，导致菌种退化，甚至淘汰。而茶树菇菌种退化导致的产量、生物学效率和商品价值降低，畸形菇数量增加，经济效益减少也制约了茶树菇的规模化发展。因此，研究茶树菇菌种提纯复壮的有效技术已成为茶树菇良种繁育工作和产业用种急待解决的重要难题，对促进整个行业的持续健康发展具有重要意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法，不仅能达到复壮的目的，还可以去除杂菌侵染和病毒感染实现提纯的目的。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法，所述方法包括如下步骤：
[0007]利用茶树菇原始菌株制备茶树菇原生质体悬浮液，经稀释、再生、培养后得到异核体菌株；
[0008]以所述的异核体菌株作为菌种，经过筛选即可得到提纯复壮的茶树菇菌株；所述筛选包括平板培养、栽培料试管培养、平板原基试验和出菇试验。
[0009]优选的，所述茶树菇原始菌株为种性退化的茶树菇子实体或菌种。
[0010]优选的，所述制备茶树菇原生质体悬浮液的方法包括如下步骤：
[0011]将7个茶树菇菌丝块接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，待菌落的菌丝相互接触时，在菌丝上滴加溶壁酶溶液进行酶解，酶解液经离心、重悬后即得所述原生质体悬浮液。
[0012]更优选的，所述溶壁酶溶液为0.6mol
·
L
‑1甘露醇溶液配制的浓度为1.5％的溶壁酶溶液。
[0013]优选的，所述稀释后的原生质体悬浮液浓度为105个/mL。
[0014]优选的，所述平板培养包括：将异核体菌株接种于PDA平板培养基中避光培养，筛
选菌丝长势、长速和抗杂菌能力较好的菌株。
[0015]优选的，所述栽培料试管培养包括：将上述PDA平板培养菌株转接到栽培料试管中培养，筛选菌丝长速、长势和抗病性较好的菌株。
[0016]优选的，所述平板原基试验包括：将菌株置于4℃环境中，在自然昼夜光照相同的条件下刺激7
‑
10d。
[0017]优选的，所述出菇试验的菌种是将菌块接种于PDB液体培养基中发酵所得。
[0018]本专利技术还提供了上述方法在茶树菇提纯复壮中的应用。
[0019]本专利技术提供了一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法，通过采用在铺有玻璃纸的平板上培养菌丝的方法制备了茶树菇原生质体，与常用的液体培养的菌丝制备原生质体的方法相比具有制备时间短、操作简单和不易污染的优点。同时，本专利技术所述方法能够筛选得到更适于生产上用种的茶树菇菌株，筛选出恢复或者超过出发菌株原有性状的再生菌株，能达到提纯复壮的目的，具有良好的应用前景。
附图说明
[0020]图1为茶树菇原生质体制备所用平板菌丝生长情况。
[0021]图2为平板菌丝酶解情况。
[0022]图3为茶树菇原生质体(
×
10)。
[0023]图4为茶树菇原生质体再生菌落的平板生长情况。
[0024]图5为茶树菇原生质体再生菌株菌丝形态(
×
40)；其中，A为异核菌株(箭头所示为锁状联合)；B为单核菌株。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法，所述方法包括如下步骤：
[0026]利用茶树菇原始菌株制备茶树菇原生质体悬浮液，经稀释、再生、培养后得到异核体菌株；
[0027]以所述的异核体菌株作为菌种，经过筛选即可得到提纯复壮的茶树菇菌株；所述筛选包括平板培养、栽培料试管培养、平板原基试验和出菇试验。
[0028]本专利技术中，所述茶树菇原始菌株优选为种性退化的茶树菇子实体或菌种。本专利技术中，所述制备茶树菇原生质体悬浮液的方法优选的包括如下步骤：将7个茶树菇菌丝块接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，待菌落的菌丝相互接触时，在菌丝上滴加溶壁酶溶液进行酶解，酶解液经离心、重悬后即得所述原生质体悬浮液。本专利技术中，所述溶壁酶溶液优选的为0.6mol
·
L
‑1甘露醇溶液配制的浓度为1.5％的溶壁酶溶液，所述溶壁酶溶液优选的由如下方法配置得到：称取溶壁酶0.09g，用6mL 0.6mol/L的甘露醇溶解，0.45μm滤膜过滤除菌。本专利技术接种7个茶树菇菌丝块能够提高获得的原生质体的得率。本专利技术中，所述酶解的温度优选为30℃，所述酶解的时间优选为150min。本专利技术中，所述重悬的试剂优选为0.6mol
·
L
‑1甘露醇溶液；所述甘露醇溶液优选的由如下方法配置得到：称取甘露醇10.93g，用双蒸水溶解定容至100mL，1
×
105Pa灭菌20min备用。
[0029]本专利技术中，所述稀释后的原生质体悬浮液浓度优选为105个/mL。本专利技术中，所述再
生优选的包括如下步骤：将稀释后的原生质体悬浮液梯度涂布于再生培养基PDMS平板上(30μL、40μL和50μL)，25℃恒温培养6
‑
7d至可见星芒状再生菌落。
[0030]本专利技术获得星芒状再生菌落后需要培养得到异核体菌株。本专利技术中，所述培养包括：每日挑取出现的较小菌落转移到PDA平板中，每个平板放6个，直到不再有再生菌落出现为止，所挑菌落长到直径0.5cm以上时，挑其边缘菌丝镜检，有锁状联合的即为异核体菌株。本专利技术对所述较小菌落的大小并没有特殊限定，只要肉眼能看见一个小点的菌落即可，所述较小菌落能够避免再生菌落过大时，两个单核再生菌落发生杂交。
[0031]本专利技术所述筛选包括平板培养、栽培料试管培养、平板原基试验和出菇试验。本专利技术中，所述平板培养优选的包括：将异核体菌株接种于PDA平板培养基中避光培养，筛选菌丝长势、长速和抗杂菌能力较好的菌株。本专利技术中，所述栽培料试管培养优选的包括：将上述PDA平板培养菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用原生质体对茶树菇进行提纯复壮的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：利用茶树菇原始菌株制备茶树菇原生质体悬浮液，经稀释、再生、培养后得到异核体菌株；以所述的异核体菌株作为菌种，经过筛选即可得到提纯复壮的茶树菇菌株；所述筛选包括平板培养、栽培料试管培养、平板原基试验和出菇试验。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茶树菇原始菌株为种性退化的茶树菇子实体或菌种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备茶树菇原生质体悬浮液的方法包括如下步骤：将7个茶树菇菌丝块接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，待菌落的菌丝相互接触时，在菌丝上滴加溶壁酶溶液进行酶解，酶解液经离心、重悬后即得所述原生质体悬浮液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶壁酶溶液为0.6mol
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L
‑1甘露醇溶液配制的浓度为1.5％的...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所江西省流域生态研究所，
类型：发明
国别省市：