一种结合HGFR蛋白的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种结合HGFR蛋白的核酸适配体及其应用，通过改进筛选条件，筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合HGFR蛋白的核酸适配体，并能与高表达HGFR蛋白的细胞系(两个细胞系验证)结合，经截短至21～28个核苷酸长度后，依然能保持与HGFR蛋白的高亲和力和高特异性结合，可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面，应用前景广阔。广阔。广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种结合HGFR蛋白的核酸适配体及其应用
[0001]本申请主张中国在先申请，申请号：202211643621.2，申请日2022年12月20日的优先权；其所有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一种结合HGFR蛋白的核酸适配体及其应用。

技术介绍

[0003]肝细胞生长因子受体(Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR)，是由原癌基因c
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met编码的一类位于细胞表面的单次跨膜受体酪氨酸激酶。HGFR信号通路的激活可促进细胞增殖，增强细胞迁移能力，诱导表皮细胞形态发生，以及抑制细胞凋亡，因此该信号通路被认为参与组织的修复与再生。目前为止已知HGFR的唯一配体是肝脏增殖因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，HGF通过结合并诱导HGFR二聚化激活HGFR信号通路，进而行使其功能。
[0004]HGFR信号通路的激活可促进细胞增殖，增强细胞迁移能力，诱导表皮细胞形态发生，以及抑制细胞凋亡，因此该信号通路被认为参与组织的修复与再生。然而，HGFR信号通路的过激活将刺激细胞过度生长，从而诱发癌症的产生；细胞迁移能力的增强将导致癌细胞的转移扩散；而抑制凋亡的活性又与癌症耐药紧密相关。
[0005]多项研究结果表明，HGFR的过度激活与多种癌症的发生和发展有紧密关联。一项针对38028位癌症患者的调查研究结果显示，其中221位患者存在HGFR过度激活的情况。体外实验研究结果也显示，HGFR过度激活的癌细胞其增殖速率更快，而且转移性更强。有学者研究发现，HGFR过度激活是恶性胶质瘤的主要诱因之一。表皮生长因子受体抑制剂目前已广泛应用于因其过度激活引起的多种癌症的治疗中，然而随着使用时间的延长，大部分患者都产生了药物抵抗。多项针对表皮生长因子抑制剂抵抗的患者的研究结果表明，HGFR过度激活导致的补偿性细胞增殖信号活化是导致患者对表皮生长因子受体抑制剂产生药物抵抗的主要原因。间接的临床证据表明，抑制HGFR可以起到治疗癌症的效果，比如BMS/Exelixis的Cabozantinib同时抑制VEGFR2和HGFR，在2012年被FDA批准用于治疗甲状腺癌；辉瑞的Crizotinib于2011年获得FDA批准用于治疗非小细胞肺癌，该抑制剂同时抑制ALK和HGFR，相信其抗癌效果也与抑制HGFR有关。另外，很多酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine KinaseInhibitor，TKI)耐药的患者身上也发现HGFR的过度激活，而研究发现联合使用HGFR抑制剂可消除这些药物抵抗效应。这些证据都表明抑制HGFR信号通路的过激活可以起到治疗癌症的效果，因此，HGFR是抗癌药物开发的候选靶标，实现HGFR的定性和定量检测、纯化，从而开发用于诊断和治疗HGFR表达异常的试剂或药物有着非常重要的意义。
[0006]核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面
展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。因此如果能找到与HGFR蛋白具有更高的亲和力，并且具有高特异性的核酸适配体，将有助于实现HGFR蛋白的高灵敏度和高特异性检测，有助于靶向HGFR蛋白的药物开发。
[0007]CN113567685B公开了一种HGFR蛋白的核酸适配体，并提供了该核酸适配体的筛选方法，但采用该方法筛选的核酸适配体与HGFR蛋白的亲和力较低，影响到后续HGFR蛋白检测的灵敏度和特异性，且序列较长无法截短，直接影响到核酸适配体后续的生产、保藏和应用的便利性。
[0008]因此，急需找到一种针对HGFR蛋白的结合亲和力高，特异性好，精确截短后依然保持高结合亲和力，易于修饰和人工合成，稳定性好，使用便利的核酸适配体。

技术实现思路

[0009]为弥补已有技术的缺陷，本专利技术提供一种结合HGFR蛋白的核酸适配体，通过改进筛选条件，筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合HGFR蛋白的核酸适配体，并且经截短至21～28个核苷酸长度后，依然能保持与HGFR蛋白的高亲和力和高特异性结合，可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面，应用前景广阔。
[0010]一方面，本专利技术提供了一种结合HGFR蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的任一项所示的核苷酸序列；或与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的任一项具有至少30％同源性且结合HGFR蛋白的核苷酸序列；或由如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的任一项所示的核苷酸序列转录的RNA序列。
[0011]本专利技术人基于SELEX技术，设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，用来筛选具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合HGFR蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些高亲和力结合HGFR蛋白的核酸适配体，分别为CM
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S0(SEQ ID NO.1)、CM
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S5(SEQ ID NO.2)、CM
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S0(SEQ ID NO.3)、CM
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S5(SEQ ID NO.4)、CM
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S0(SEQ ID NO.5)和CM
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046
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S3(SEQ ID NO.6)，该核酸适配体与HGFR蛋白具有更高的亲和力，并且具有更高的特异性。
[0012]其中，CM
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S5为从CM
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S0中截短至仅含有21个核苷酸的核酸适配体而获得，从CM
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005
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S0中截短的方式有很多种，可以获得很多条新的核酸适配体，但是大部分与HGFR蛋白的亲和力都会出现下降；本专利技术经过大量筛选，发现CM
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S5是最优的截短后的核酸适配体，CM
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S5与CM
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S0相比与HGFR蛋白的亲和力并未下降，反而上升。
[0013]其中，CM
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S5为从CM
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S0中截短至仅含有28个核苷酸的核酸适配体而获得，从CM
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041
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结合HGFR蛋白的核酸适配体，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的任一项所示的核苷酸序列；或与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的任一项具有至少30％同源性且结合HGFR蛋白的核苷酸序列；或由如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6中的任一项所示的核苷酸序列转录的RNA序列。2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的核酸适配体，是从如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中截短而获得；具有如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的核酸适配体，是从如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中截短而获得；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的核酸适配体，是从如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列中截短而获得。3.如权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、或SEQ ID NO.6中的任一项所示的核苷酸序列。4.一种核酸适配体的缀合物或衍生物，其特征在于，所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6中的任一项所示的核苷酸序列；所述核酸适配体的缀合物包括荧光标记物；所述核酸适配体的衍生物包括由核...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，罗昭锋，张峥，刘湘圣，吕少康，刁寒，
申请(专利权)人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所筹，
类型：发明
国别省市：