一种异源二聚体蛋白纯度的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种异源二聚体蛋白纯度的检测方法，流动相为十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和氯化钠的混合水溶液，其中十二水合磷酸氢二钠浓度为40～80mM，二水合磷酸二氢钠浓度为20～60mM。本发明专利技术的检测方法可以很好的将二聚体蛋白与杂质分离开来，具有快速、简便、检测限低、灵敏度高等优点，适于工业化生产。产。产。

【技术实现步骤摘要】
一种异源二聚体蛋白纯度的检测方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种异源二聚体蛋白纯度的检测方法。

技术介绍

[0002]现代生物工程多采用哺乳动物细胞生产蛋白质药物，细胞培养液中的蛋白质的表达量随培养时间发生变化，在培养后期需要频繁取样监控以寻找投入和产出的最佳平衡点。在细胞培养过程中，细胞分泌的蛋白质分子由于所处的液体环境、机械环境和分子自身物理化学属性等，会发生不同程度的聚集，这对于蛋白质的生产是不期望发生的，会影响工艺的收率和产品质量，因此监控培养物中蛋白质的聚集体百分比也是评价培养工艺的重要参数。此外，蛋白聚集对于蛋白药物的安全性和有效性有着极大的影响，蛋白质聚体可能由于较大的分子量而影响其穿膜特性，导致生物利用度降低，还可能产生免疫源性，给药后将给患者带来潜在风险，因此蛋白纯度检测成为蛋白质药物质量控制的重要指标之一。
[0003]目前蛋白含量测定主要有三种常用的方法：亲和高效液相色谱法、非还原蛋白质电泳和体积排阻色谱法(SEC)。其中，亲和高效液相色谱法测定蛋白质表达量，其测定的蛋白质表达量是包含蛋白质的聚集体形态、单体形态和含有Fc的片段的加和值，而一般只有单体形态的蛋白质才是所需的，因此这种方法测定的结果不是准确的目标分子(单体形态)的表达量。非还原蛋白质电泳则需要在变性条件下操作，可能会影响聚集体成分的含量测定。体积排阻色谱法(SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，其检测条件比较温和，不会对蛋白质的天然形态产生大的影响。因此，体积排阻色谱法(SEC)一般用于产业上进行产品的蛋白聚集体相关杂质的质量控制。但目前公开的体积排阻色谱法(SEC)用于检测蛋白中聚体杂质时，常出现分离度差或无法分离聚体杂质的问题，且某些方法稳定性较差，检测灵敏度较低，不适于低浓度聚体杂质的分离检测。
[0004]因此，为了进一步保障蛋白药物的质量安全，有必要建立一种快速、简便、灵敏、稳定的体积排阻色谱检测方法。

技术实现思路

[0005]在本申请中，专利技术人提供一种快速、简便、灵敏度高、稳定性好的检测方法，用于异源二聚体蛋白的纯度检测。
[0006]本专利技术提供了一种异源二聚体蛋白纯度的检测方法，所述方法包括以下步骤：色谱条件：色谱柱以硅胶为填充剂；流动相为十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和氯化钠的混合水溶液；其中，十二水合磷酸氢二钠浓度为40～80mM，二水合磷酸二氢钠浓度为20～60mM；洗脱方式为等度洗脱；记录色谱图。
[0007]在一些实施方案中，所述十二水合磷酸氢二钠浓度为50～70mM。
[0008]在一些实施方案中，所述二水合磷酸二氢钠浓度为30～50mM。
[0009]在一些实施方案中，所述十二水合磷酸氢二钠浓度为60mM，二水合磷酸二氢钠浓
度为40mM。
[0010]在一些实施方案中，所述氯化钠浓度为80～120mM；优选地，所述氯化钠浓度为90～110mM；更优选地，所述氯化钠浓度为100mM。
[0011]在一些实施方案中，所述流动相的pH为6.5～7.5；优选地，所述流动相的pH为7.0。
[0012]在一些实施方案中，所述色谱柱为Waters XBridge BEH SEC3.5μm色谱柱。
[0013]在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：流动相流速为0.2～0.8mL/min；柱温为25～35℃；进样体积为25～35μL；检测波长为274～286nm；和/或样品室温度为5～15℃。
[0014]在一些实施方案中，所述流动相流速为0.5mL/min。
[0015]在一些实施方案中，所述柱温为30℃。
[0016]在一些实施方案中，所述进样体积为30μL。
[0017]在一些实施方案中，所述检测波长为280nm。
[0018]在一些实施方案中，所述样品室温度为10℃。
[0019]在一些实施方案中，所述异源二聚体蛋白包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列所示的重链1的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列所示的轻链的LCDR1、LCDR2和LCDR3；优选地，所述异源二聚体蛋白质包含如SEQ IDNO:7的氨基酸序列所示的重链1，如SEQ ID NO:8的氨基酸序列所示的重链2，和SEQ ID NO:9的氨基酸序列所示的轻链。
[0020]在一些实施方案中，所述异源二聚体蛋白浓度为3mg/mL。
[0021]在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(1)流动相配制：称取适量十二水合磷酸氢二钠、适量二水合磷酸二氢钠、适量氯化钠，加水溶解，过滤，即得；(2)供试品溶液配制：取待测蛋白适量，用流动相将其稀释，离心，取上清液作为供试品溶液。
附图说明
[0022]图1为对比例1中的蛋白色谱检测图谱。
[0023]图2为对比例2中的蛋白色谱检测图谱。
[0024]图3为对比例3中的蛋白色谱检测图谱。
[0025]图4为对比例4中的蛋白色谱检测图谱。
[0026]图5为对比例5中的蛋白色谱检测图谱。
[0027]图6为实施例1中的蛋白色谱检测图谱。
具体实施方式
[0028]以下结合附图与具体实施例对本专利技术做进一步的描述，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本专利技术的保护范围。
[0029]对比例1
[0030]称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·
12H2O)21.84g，二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·
2H2O)6.08g，氯化钠(NaCl)5.84g，加水溶解并定容至1L，经0.45μm滤膜过滤，即得流动相。根据表1制备待测蛋白(即待测异源二聚体蛋白质溶液)，其中，异源二聚体蛋白质包含如SEQ ID NO:7的氨基酸序列所示的重链1，如SEQ ID NO:8的氨基酸序列所示的重链2，和SEQ ID NO:9的氨基酸序列所示的轻链。其中，所述轻链和重链1复合以形成对肿瘤抗原或免疫检查点的结合特异性的靶向部分，所述重链2包含Fc区域及与Fc区域融合的免疫调节剂，所述轻链、重链1、重链2复合以形成所述异源二聚体蛋白质。
[0031]表1待测蛋白组分及其含量
[0032]组分含量异源二聚体蛋白质10.00g/L聚山梨酯800.20g/L组氨酸1.72g/L盐酸组氨酸1.87g/L海藻糖51.35g/L注射用水适量，至1L
[0033]取待测蛋白，用流动相稀释至蛋白浓度约为3mg/mL的溶液，12000rpm，离心5m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异源二聚体蛋白纯度的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：色谱条件：色谱柱以硅胶为填充剂；流动相为十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和氯化钠的混合水溶液，其中十二水合磷酸氢二钠浓度为40～80mM，二水合磷酸二氢钠浓度为20～60mM；洗脱方式为等度洗脱；记录色谱图。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述十二水合磷酸氢二钠浓度为50～70mM。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述二水合磷酸二氢钠浓度为30～50mM。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述氯化钠浓度为80～120mM。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述氯化钠浓度为90～110mM。6.根据权利要求1
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5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的pH为6.5～7.5。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：流动相流速为0.2～0.8mL/min；柱温为25～35℃；进样体积为25～35μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：武慧敏，殷刘松，姜晓玲，
申请(专利权)人：盛禾中国生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：