一种测定质粒中2-巯基吡啶含量的方法技术

本发明专利技术涉及成分分析技术领域，特别是涉及一种测定质粒中2

【技术实现步骤摘要】
一种测定质粒中2
‑
巯基吡啶含量的方法


[0001]本专利技术涉及成分分析
，特别是涉及一种测定质粒中2
‑
巯基吡啶含量的方法。

技术介绍

[0002]质粒作为细胞与基因治疗药品的生产原料，需要对其功能进行鉴定和控制；为保证安全性，对溶剂或杂质残留(乙醇、异丙醇、醋酸、2
‑
巯基吡啶)需进行检测，限度标准控制在≤0.5％。质粒生产过程中常用层析法进行纯化，不同开发阶段和使用级别对质粒的质量要求不同。质粒纯化的目的在于去除宿主DNA、RNA、蛋白和内毒素以及非超螺旋的质粒变体，以满足针对目标产品的使用要求，纯化过程的优化可提高质粒产量、降低成本。
[0003]然而质粒在使用层析法进行纯化时，属于亲和层析填料配基的2
‑
巯基吡啶在纯化过程中有可能掉落，会随着收集的样品共同流穿，为确定配基是否存在掉落的可能，可通过检测质粒中2
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巯基吡啶的含量来确定。
[0004]文献记载给小鼠腹腔和静脉注射LD50(mouse)＝250mg/kg的2
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巯基吡啶，会造成皮肤刺激及眼部严重刺激，可引起呼吸道刺激。足以证明2
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巯基吡啶残留量达到一定程度造成的危害还是比较大的。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种测定质粒中2
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巯基吡啶含量的方法，用于解决现有技术中的问题。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种测定质粒中2
‑
巯基吡啶含量的方法，包括如下步骤：将待测质粒用溶剂溶解后采用HPLC检测其中的2
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巯基吡啶含量。
[0007]具体的，所述检测方法包括如下步骤：
[0008]1)配制标准溶液：取2
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巯基吡啶标准品用溶剂溶解后，梯度稀释配成标准溶液；
[0009]2)配制供试品溶液：将待测质粒用溶剂溶解；
[0010]3)样品检测：采用HPLC分别检测标准溶液和供试品溶液，获得关于峰面积和2
‑
巯基吡啶含量的标准曲线，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线计算获得供试品溶液中2
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巯基吡啶的含量。
[0011]在一种实施方式中，步骤3)中HPLC的色谱柱为C18柱。
[0012]在一种实施方式中，检测波长为260～300nm。
[0013]如上所述，本专利技术的测定质粒中2
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巯基吡啶含量的方法，具有以下有益效果：HPLC可以有效测定质粒中2
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巯基吡啶含量，可以运用到生产检验，改进质粒生产工艺中2
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巯基吡啶的残留量提供重要参考，降低2
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巯基吡啶杂质，以得到相对纯净的质粒。
附图说明
[0014]图1显示为本专利技术的标准曲线溶液色谱图。
[0015]图2显示为本专利技术的回收率样品溶液色谱图。
[0016]图3显示为本专利技术2
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巯基吡啶的线性图。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供一种测定质粒中2
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巯基吡啶含量的方法，包括如下步骤：将待测质粒用溶剂溶解后采用HPLC检测其中的2
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巯基吡啶含量。
[0018]2‑
巯基吡啶CAS登录号为2637
‑
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‑
5。
[0019]本专利技术中质粒为本领域常规意义的质粒，即为一种小型、环状DNA或RNA分子。
[0020]质粒选自克隆质粒、表达质粒、基因敲减质粒、基因工程质粒、报告质粒、病毒质粒等。
[0021]在一种实施方式中，采用外标法检测2
‑
巯基吡啶含量。
[0022]具体的，所述检测方法包括如下步骤：
[0023]1)配制标准溶液：取2
‑
巯基吡啶标准品用溶剂溶解后，梯度稀释配成标准溶液；
[0024]2)配制供试品溶液：将待测质粒用溶剂溶解；
[0025]3)样品检测：采用HPLC分别检测标准溶液和供试品溶液，获得关于峰面积和2
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巯基吡啶含量的标准曲线，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线计算获得供试品溶液中2
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巯基吡啶的含量。
[0026]在本专利技术的某些实施方式中，步骤1)中标准品溶液中2
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巯基吡啶的浓度为1～50μg/mL。在一种实施方式中，所述标准品溶液包括1、5、10、20、50μg/mL系列梯度浓度。
[0027]在本专利技术的某些实施方式中，步骤1)中溶剂为有机溶剂和/或水。所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈中的任一种或多种。在一种实施方式中，所述溶剂为有机溶剂和水。在一较佳的实施方式中，甲醇和水的体积比为2～4:7，优选的为2.5～3.5:7。
[0028]具体的，步骤2)中将待测质粒使用有机溶剂和/或水溶解。所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈中的任一种或多种。在一种实施方式中，使用有机溶剂和水的混合溶剂溶解待测质粒。在一较佳的实施方式中，甲醇和水的体积比为2～4:7。优选的，为2.5～3.5:7。
[0029]在一种实施方式中，质粒与溶剂的质量体积比为1:(30～500)，单位分别为μg和μL。
[0030]在一种实施方式中，步骤3)中HPLC的色谱柱为C18柱。C18色谱柱是一种十八烷基硅烷键合硅胶填料的反相色谱柱，它对化合物分离的作用力单一。
[0031]在一种实施方式中，色谱柱的柱长
×
内径
×
固定相膜厚度为250～300mm
×
4.0～5.0mm
×
4～6μm。
[0032]在一种实施方式中，色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶。
[0033]在一种实施方式中，流动相为甲醇：水＝2～4:7。优选的为2.5～3.5:7。使用等度洗脱，分析时间为5～15min。优选的的，分析时间为8～12分钟。
[0034]在一种实施方式中，进样量为5～50μL。在一较佳实施方式中，进样量为5～10μL。
[0035]在一种实施方式中，检测器为紫外检测器VWD，柱温为20～30℃，流速为0.5～1.0mL/min。
[0036]在一种实施方式中，检测波长为260～300nm。在一较佳实施方式中，检测波长为270～290nm。根据2
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巯基吡啶的化合物结构含吡啶，吡啶的紫外吸收光谱260～300nm会有
强烈吸收，利用紫外分光光度计进行400nm～190nm光谱扫描，在270～290nm吸收最大，因此选择检测波长为270～290nm。
[0037]在一种实施方式中，所述标准工作曲线中，以2
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巯基吡啶的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其浓度为横坐标(X轴)，得到相应的标准工作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定质粒中2
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巯基吡啶含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测质粒用溶剂溶解后采用HPLC检测其中的2
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巯基吡啶含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用外标法检测2
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巯基吡啶含量。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：1)配制标准溶液：取2
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巯基吡啶标准品用溶剂溶解后，梯度稀释配成标准溶液；2)配制供试品溶液：将待测质粒用溶剂溶解配成供试品溶液；3)样品检测：采用HPLC分别检测标准溶液和供试品溶液，根据标准品溶液中2
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巯基吡啶含量的浓度和峰面积获得标准曲线，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线计算获得供试品溶液中2
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巯基吡啶的含量。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中标准品溶液中2
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巯基吡啶的浓度为1～50μg/mL。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)或2)中溶剂为有机溶剂和/或水；优选的，步骤1)中所述溶剂为...

【专利技术属性】
技术研发人员：余学军，崔倩倩，张燕娜，茅健，陈鑫，桂利红，黄舒银，任国强，王旭，
申请(专利权)人：华道上海生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：