海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法技术

海参肠道组织蛋白酶Ｂ的分离纯化方法，在４℃下用含Ｌ－Ｃｙｓ的醋酸钠缓冲液对海参肠匀浆破碎缓冲液浸提，采用硫酸铵分级沉淀，沉淀再用上述醋酸钠缓冲液溶解沉淀，透析除盐后浓缩得到组织蛋白酶Ｂ粗酶。将得到的组织蛋白酶Ｂ粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱和高效液相色谱中的２～３种方法达到纯化的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于从海洋动物提取蛋白酶，同时涉及采用离子交换层析技术、凝 胶层析技术、高效液相色谱技术、冷冻干燥的技术等领域。
技术介绍
溶酶体中存在多种组织蛋白酶，目前已从鱼贝类肌肉和内脏中纯化并鉴定 IO种组织蛋白酶，即组织蛋白酶A、 B、 C、 D、 E、 H、 L、 L-like、 X及S。对组织蛋白酶B的研究主要集中在鱼类。目前，已从gray mullet、 tilapia mossambica、鲭鱼、common Mackerel、 chun salmon、鲤鱼肌肉中纯化了组织蛋 白酶B，并对其进行了鉴定。组织蛋白酶B(Cathepsin B,CB)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白水解酶，具有内 肽酶活及羧肽酶活，对肌肉蛋白质有广泛的降解作用。研究表明，在pH5.0时， CB能够水解肌球蛋白、肌钙蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白。CB的催化作用由 Cys， His实现，易被巯基试剂抑制，又称巯基酶，属于木瓜蛋白酶家族。近年 来研究发现，组织蛋白酶也参与细胞凋亡过程，其中组织蛋白酶B、 C等能直 接或间接地激活Caspase (天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)而触发细胞凋亡， 从而加速组织自溶。目前，尚未有海参肠道组织蛋白酶B的相关提取方法，也未见到相关的文 献合信息报道。
技术实现思路
针对海参贮存十分困难，因为其体内存在的酶类的协同催化作用可将自身 体内的蛋白质水解，引发海参神奇的自溶现象。本专利技术旨在研究海参自溶相关 的组织蛋白酶B，对海参自溶酶系的研究，将有助于延长海参贮存期、优化加工 条件及其开发出更有营养价值的功能性食品。本专利技术的技术方案是在低温条件下，对海参肠匀浆破碎，缓冲液浸提， 采用硫酸铵分级沉淀提取组织蛋白酶B粗酶。并依次利用离子交换树脂、凝胶 层析技术使粗酶达到纯化。具体操作步骤为1. 海参的处理取新鲜活海参，去体壁后将海参肠清洗，去除泥沙和杂质。2. 粗酶的提取将其用1 20倍海参肠体积的0"C的含5 200mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸) 的5 200mmol/LpH3.0 6.8的醋酸钠缓冲液匀浆破碎；在4"C下浸提4 18h， 采用6000 20000Xg (4°C)冷冻离心5 60min，取上层清液。选择硫酸铵饱 和度为10% 卯％，对所得上层清液进行硫酸铵分级沉淀，经6000 20000Xg (4°C)冷冻离心20 60min后，取沉淀，并用上述醋酸钠缓冲液溶解沉淀，透 析除盐后浓縮，即得到组织蛋白酶B粗酶。所述硫酸铵分级沉淀目的是在不同的硫酸铵饱和度下使不同的蛋白质从溶 液中沉淀析出，选择目的蛋白的最大饱和度作为硫酸铵的最终饱和度。本实验 选用5 200mmol/L pH 3.0 6.8的醋酸钠缓冲液作为提取海参肠组织蛋白酶B 的浸提液。具体操作如下取新鲜海参肠用上述浸提液浸提，匀浆捣碎后经冷 冻离心5 60min后，取上清液，平均分成6份后并在4'C和磁力搅拌下依次向 上清液中加入研磨后的硫酸铵，使其饱和度分别达到0%、 20%、 40%、 60%、 80%、 90% ，静置4h后，冷冻离心20 60min，取上清液测定酶活力。选取酶 活力最大所在的硫酸铵饱和度作为分级沉淀的条件。3. 组织蛋白酶的纯化将得到的组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱、高效液相色 谱中的2 3种方法达到纯化的目的，其中离子交换层析色谱是必须使用的。凝 胶色谱可以用 一种或两种不同的层析方法先后进行纯化。(1) 离子交换色谱采用DEAE Sepharose CL-6B，采用含0.01 10 mmol/L 的NaCl的5 200mmol/LL-Cys的pH5.0 6.5的磷酸钠缓冲液线性洗脱，流速 为0.5ml/min,将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓縮。(2) 凝胶色谱采用G-75或/和Sephacryl 100HR方法G-75凝胶层析采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/L L-Cys 的pH5.0 6.5的磷酸钠缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集， 透析除盐后浓縮。Sephacryl 100 HR凝胶层析采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/LL-Cys的pH5.0 6.5的磷酸钠缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓縮。(3)高效液相色谱技术采用凝胶色谱柱TSK-3000 SWxl (日本东洋曹达 TOSOH 7.8 mmX 300 mm 5 u m)，用0.01 10 mmol/L的Na2S04洗脱，流速 为0.1 0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓縮。 在酶的浓縮部分可以采用以下三种方法之一进行(1) 采用超滤浓縮法选择1000 10000分子量的超滤膜，将小分子蛋白和金属离子去除，达到 浓縮的目的。(2) 采用聚乙二醇浓縮法 将所需浓縮的酶液装于分子量为10000的透析袋内后，置于4'C条件下的烧杯中，向其中添加聚乙二醇，直到透析袋被覆盖，当透析袋内溶剂渗出即被聚 乙二醇迅速吸去，从而达到浓縮的目的。(3) 采用冷冻干燥技术将得到的粗酶冷冻干燥得到干粉，将干粉复溶于l 2ml浸提液中，形成溶 液，以达到浓縮的目的。 本专利技术突出的优点是1. 首次从海参肠分离纯化得到组织蛋白酶B。2. 对组织蛋白酶B的研究为海参自溶过程生理生化变化机制和代谢途径的研 究奠定基础，为海参深加工研究提供理论依据。3. 丰富了酶学理论，对海参自溶酶系的研究，将有助于延长海参贮存期、优 化加工条件及其开发出更有营养价值的功能性食品。具体实施例方式实例一取新鲜活海参，去体壁后将海参肠清洗，去除泥沙和杂质。将其用5倍海 参肠体积的0。C的含5mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的5mmol/LpH 3.0的醋酸钠 缓冲液匀浆破碎；在4。C下浸提4h，采用6000Xg (4°C)冷冻离心60min，取 上层清液。选择硫酸铵饱和度为65%，进行硫酸铵分级沉淀，经20000Xg(4"C) 冷冻离心60min后，取沉淀，将沉淀用50ml上述醋酸钠缓冲液溶解，透析除盐 后，超滤浓縮，即得到组织蛋白酶B粗酶。将得到的组织蛋白酶B粗酶过DEAE Sepharose CL-6B离子交换色谱柱，采用含0.5 2.0mmol/L的NaCl的50mmol/L6L-Cys pH6.5的磷酸钠缓冲液线性洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收 集。收集的酶液透析除盐后，超滤浓縮，过SephacryllOOHR凝胶层析色谱柱， 将有酶活力的部分收集，透析除盐，超滤浓縮。 实例二取新鲜活海参，去体壁后将海参肠清洗，去除泥沙和杂质。将其用3倍海 参肠体积的(TC的含1Ommol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的5mmol/L pH 6.0的醋酸 钠缓冲液匀浆破碎；在4t:下浸提6h，采用15000Xg (4°C)冷冻离心30min， 取上层清液。选择硫酸铵饱和度为40%，进行硫酸铵分级沉淀，经15000Xg(4°C) 冷冻离心60min后，取沉淀，将沉淀用50ml上述醋酸钠缓冲液溶解，透析除盐， 采用聚乙二醇法浓縮后，即得到组织蛋白酶B粗酶。将得到的组织蛋白酶B粗本文档来自技高网...

【技术保护点】
海参肠道组织蛋白酶Ｂ的分离纯化方法，其特征在于操作步骤为：　（１）海参处理　取新鲜活海参，去体壁后将海参肠清洗，去除泥沙和杂质；　（２）粗酶提取　将其用１～２０倍海参肠体积的０℃的含５～２００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－Ｃｙｓ （Ｌ－半胱氨酸）的５～２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　３．０～６．８的醋酸钠缓冲液匀浆破碎；在４℃下浸提４～１８ｈ，６０００～２００００×ｇ冷冻离心５～６０ｍｉｎ，取上层清液用选择好的硫酸铵饱和度进行硫酸铵分级沉淀，后４℃下经６０００～２００００×ｇ冷冻离心２０～６０ｍｉｎ，取沉淀，并用上述醋酸钠缓冲液溶解沉淀，透析除盐后浓缩，即得到组织蛋白酶Ｂ粗酶；　（３）酶的纯化　将得到的组织蛋白酶Ｂ粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱和高效液相色谱中的２～３种方法达到纯化的目的，其中 离子交换层析色谱是必须使用的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱蓓薇，周大勇，董秀萍，于蕾，孙黎明，吴海涛，宫国君，刘晶，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]