一种细胞超薄切片的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及IPC G01N1领域，进一步的，涉及一种细胞超薄切片的制备方法及应用。包括以下步骤：(1)样品采集；(2)预固定；(3)琼脂预包埋；(4)固定；(5)脱水、渗透、包埋；(6)超薄切片；(7)染色。本发明专利技术采用单宁酸代替锇酸对样品进行固定，避免了锇酸对人体健康的伤害，并降低了成本；在单宁酸固定过程中，加入醋酸双氧铀再次进行固定，既可以避免细胞膜不完整，避免细胞间出现大量细胞碎片现象，还可以避免细胞发生肿胀，并且进一步提升后续细胞的染色效果，特别是适用于CHO细胞的固定。胞的固定。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞超薄切片的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及IPC G01N1领域，进一步的，涉及一种细胞超薄切片的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]透射电镜主要用于观察细胞内部的细微结构，由于电子的穿透力较弱，故用于透射电镜观察的标本，必须切成50nm左右的超薄切片。样品在进行超薄切片之前，首先要经过固定、脱水和包埋等处理，在切片之后还要经过染色等处理才能进行电镜观察，传统细胞超薄切片制备过程中需要使用锇酸进行固定，锇酸是一种剧毒化学品，中等剂量可使人致死。根据《危险化学品安全管理条例》规定，锇酸的购买、运输、储存、使用等过程均受公安部门的严格监管，管理成本比较高。比如李鑫辉等人在《生物化学与生物物理进展》上发表的不同厚度细胞薄切片对AFM图像反差的影响，其公开的切片样品制备方法即采用1％锇酸固定液对细胞进行固定。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种细胞超薄切片的制备方法，包括以下步骤：(1)样品采集；(2)预固定；(3)琼脂预包埋；(4)固定；(5)脱水、渗透、包埋；(6)超薄切片；(7)染色。
[0004]优选的，所述步骤(2)中预固定的固定液选自戊二醛溶液、甲醛溶液、甲醇溶液、乙醇溶液、多聚甲醛溶液中的任意一种。
[0005]优选的，所述步骤(2)中预固定的固定液为戊二醛溶液。
[0006]优选的，所述戊二醛溶液配制使用的溶剂为PB缓冲液(磷酸盐缓冲液)、PBS缓冲液(磷酸盐水缓冲液)或生理盐水。/>[0007]优选的，所述戊二醛溶液配制使用的溶剂为PB缓冲液。
[0008]优选的，所述PB缓冲液的浓度为0.05～0.2mol/L。
[0009]优选的，所述PB缓冲液的浓度为0.1mol/L。
[0010]优选的，所述步骤(2)中预固定的具体方法为：采用戊二醛溶液在温度为2～8℃下，固定10～15h。
[0011]优选的，所述戊二醛溶液的体积浓度为2～4％。
[0012]优选的，所述步骤(3)中琼脂预包埋的具体方法为：配制琼脂糖水溶液，使琼脂糖水溶液与样品混合均匀，冷却凝固，然后使用0.1mol/L PBS缓冲液冲洗3～5次，每次5～15min。
[0013]优选的，所述琼脂糖水溶液的质量浓度为1～3％。
[0014]优选的，所述步骤(4)中固定过程使用单宁酸溶液进行固定。
[0015]优选的，所述单宁酸溶液配制使用的溶剂为水、丙酮、PB缓冲液、PBS缓冲液、二甲胂酸钠缓冲液或生理盐水。
[0016]优选的，所述单宁酸溶液配制使用的溶剂为水、乙醇和丙酮混合液。
[0017]优选的，所述水、乙醇和丙酮的体积比为(60～70)：(30～40)：1。
[0018]优选的，所述水、乙醇和丙酮的体积比为65：34：1。
[0019]优选的，所述单宁酸溶液固定的具体方法为：采用单宁酸溶液在温度为22～25℃下，固定1～4h，然后使用0.1mol/L PB缓冲液冲洗3～5次，每次5～15min。
[0020]优选的，所述单宁酸溶液的质量浓度为0.5～2％。
[0021]优选的，所述单宁酸溶液的质量浓度为1％。
[0022]优选的，所述步骤(4)中固定的具体方法为：采用单宁酸溶液在温度为22～25℃下，固定2.5h，然后使用0.1mol/L PB缓冲液冲洗4次，每次10min。
[0023]优选的，所述步骤(4)固定过程还包括使用醋酸双氧铀溶液进行固定。
[0024]优选的，所述醋酸双氧铀溶液配制使用的溶剂为丙酮。
[0025]优选的，所述醋酸双氧铀溶液固定的具体方法为：采用醋酸双氧铀溶液在温度为2～8℃下，固定1～3h，然后使用0.1mol/L PB缓冲液冲洗3～5次，每次5～15min。
[0026]优选的，所述醋酸双氧铀溶液的质量浓度为1％～3％。
[0027]优选的，所述醋酸双氧铀溶液的质量浓度为2％。
[0028]优选的，所述醋酸双氧铀溶液固定的具体方法为：采用醋酸双氧铀溶液在温度为4℃下，固定2h，然后使用0.1mol/L PB缓冲液冲洗4次，每次10min。
[0029]本专利技术中采用单宁酸对样品进行固定，单宁酸是植物生长过程中，植物代谢产生的次生物，是一类可溶于水的多酚类化合物，单宁酸可以固定许多蛋白质、糖类衍生物、多肽和饱和磷脂；但在实验过程中，本申请人发现仅仅采用单宁酸进行固定，使得染色后细胞超薄切片有时会出现细胞边缘不清晰，图像不清晰的现象；本申请人意外发现，当在单宁酸固定过程中，加入醋酸双氧铀再次进行固定，并且控制单宁酸溶液的质量浓度为1％，固定时间为3h，丙酮配制的醋酸双氧铀溶液质量浓度为2％，固定时间为2h，既可以避免细胞膜不完整，避免细胞间出现大量细胞碎片现象，还可以避免细胞发生肿胀，并且可以进一步提升后续细胞的染色效果，特别是适用于CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)的固定。本申请人猜测：单宁酸由于分子量较大，对细胞的渗透作用差，采用单宁酸进行细胞固定可能会导致对细胞固定不均匀，效果不好。而当在单宁酸固定之后再次使用醋酸铀进行固定，醋酸双氧铀可以与磷酸基团反应，还可以与蛋白中的酸性基团和碱性基团反应，从而进一步固定细胞。通过控制单宁酸和醋酸双氧铀的质量浓度以及单宁酸和醋酸双氧铀固定的时间，进而提高超薄切片细胞的整体性能。
[0030]优选的，所述步骤(5)中脱水的具体方法为：先采用乙醇体积百分比为30～90％的乙醇水溶液进行脱水，再采用丙酮体积百分比为90％～100％的丙酮水溶液进行脱水。
[0031]优选的，所述步骤(5)中脱水的具体方法为：采用乙醇体积百分比为30％的乙醇水溶液、乙醇体积百分比为50％的乙醇水溶液、乙醇体积百分比为70％的乙醇水溶液以及乙醇体积百分比为90％的乙醇水溶液各脱水10～15min，再用丙酮体积百分比为90％的丙酮水溶液、100％丙酮各脱水15～20min。
[0032]优选的，所述步骤(5)中渗透的具体方法为：采用丙酮：树脂＝2：(1～4)进行渗透。
[0033]优选的，所述步骤(5)中渗透的具体方法为：采用丙酮：树脂＝2：1、1：1、1：2的溶液，分别渗透0.5～1.5h、1.5～2.5h、1.5～2.5h。
[0034]优选的，所述树脂选自SPon812环氧树脂、Epon812环氧树脂、Spurr环氧树脂、TAAB812环氧树脂、环氧树脂618中的任意一种。
[0035]优选的，所述树脂为Epon812环氧树脂。
[0036]优选的，所述步骤(5)中包埋的具体方法为：采用Epon812环氧树脂进行包埋，分别在40～50℃下包埋18～26h、在55～60℃下包埋18～26h。
[0037]优选的，所述步骤(6)中超薄切片的厚度为50～100nm。
[0038]优选的，所述步骤(7)中染色的具体方法为：先采用醋酸双氧铀染色15～25min，用去离子水冲洗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞超薄切片的制备方法，包括以下步骤：包括以下步骤：(1)样品采集；(2)预固定；(3)琼脂预包埋；(4)固定；(5)脱水、渗透、包埋；(6)超薄切片；(7)染色。2.如权利要求1所述的一种细胞超薄切片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中预固定的固定液选自戊二醛溶液、甲醛溶液、甲醇溶液、乙醇溶液、多聚甲醛溶液中的任意一种。3.如权利要求1所述的一种细胞超薄切片的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中琼脂预包埋的具体方法为：配制琼脂糖水溶液，使琼脂糖水溶液与样品混合均匀，冷却凝固，然后使用0.1mol/L PB缓冲液冲洗3～5次，每次5～15min。4.如权利要求1所述的一种细胞超薄切片的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中固定过程使用单宁酸溶液进行固定；所述单宁酸溶液固定的具体方法为：采用单宁酸溶液在温度为22～25℃下，固定1～4h，然后使用0.1mol/L PB缓冲液冲洗3～5次，每次5～15min。5.如权利要4所述的一种细胞超薄切片的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)固定过程还包括使用醋酸双氧铀溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨佳佳，卢云，刘金良，吴晨，
申请(专利权)人：微谱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：