P19蛋白在调控绿脓杆菌毒力中的应用制造技术

本发明专利技术公开了香石竹意大利环斑病毒P19蛋白在调控绿脓杆菌毒力中的应用。本发明专利技术通过构建香石竹意大利环斑病毒P19蛋白的重组表达载体并转入绿脓杆菌中发现，该蛋白可以调控绿脓菌素的合成，影响绿脓杆菌的毒力，进而可将其用于防治绿脓杆菌，为绿脓杆菌的防治提供了新方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
P19蛋白在调控绿脓杆菌毒力中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
更具体地，涉及香石竹意大利环斑病毒P19蛋白在调控绿脓杆菌毒力中的应用。

技术介绍

[0002]绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)又称铜绿假单胞菌，在自然界中分布广泛，为土壤中最常见的细菌之一，其在各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等环境中也均有存在。绿脓杆菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一，患代谢性疾病、血液病或恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染此菌，且大量的使用绿脓杆菌抗生素等使其产生了耐药性，亟需寻找新的防治方法。
[0003]P19蛋白是在植物病毒香石竹意大利环斑病毒中发现的一种siRNA结合蛋白。Huang等通过构建重组载体，将外源dsDNA转入了大肠杆菌中，再由大肠杆菌中的核糖核酸酶Ⅲ将载体上的dsDNA转化为siRNA片段，发现P19蛋白可以结合此类siRNA(Huang L,Jin J,Deighan P,et al.Efficient and specific gene knockdown by small interfering RNAs produced in bacteria[J].Nature Biotechnology,2013,31(4):350
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356.)。而关于P19蛋白的更多功能和应用还有待进一步发现。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供香石竹意大利环斑病毒P19蛋白在调控绿脓杆菌毒力中的应用。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供香石竹意大利环斑病毒P19蛋白在在调控绿脓杆菌毒力中的应用。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供香石竹意大利环斑病毒P19突变体蛋白在防治绿脓杆菌或在制备防治绿脓杆菌的药物中的应用。。
[0007]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术发现将编码香石竹意大利环斑病毒P19蛋白的核苷酸序列通过构建重组表达载体转入绿脓杆菌(P.Aeruginosa)诱导表达后，绿脓杆菌的毒力发生了变化。进一步分析发现，在绿脓杆菌中表达P19蛋白可以使绿脓杆菌中绿脓菌素的含量增加，而对P19蛋白进行突变后再在绿脓杆菌中进行表达则使得其绿脓菌素的含量降低，抑制绿脓菌素的合成，表明可通过P19蛋白对绿脓杆菌绿脓菌素的合成进行调控。
[0009]绿脓菌素是由绿脓杆菌分泌的一种具有特殊的颜色和氧化还原能力的吩嗪类化合物。绿脓菌素不仅是绿脓杆菌中一种重要的毒力因子，其还可以作为信号分子调节绿脓杆菌的基因表达，促进生物被膜的形成。此外，绿脓菌素对绿脓杆菌抵抗抗生素也有一定作用，因而可将P19蛋白用于调控绿脓杆菌绿脓菌素的合成，进而用于防治绿脓杆菌。
[0010]因此，本专利技术申请保护香石竹意大利环斑病毒P19蛋白在调控绿脓杆菌毒力中的应用。
[0011]具体为香石竹意大利环斑病毒P19蛋白通过调控绿脓杆菌绿脓菌素合成在调控绿脓杆菌毒力中的应用。
[0012]具体地，所述P19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码P19蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]具体地，在绿脓杆菌中表达P19蛋白时其绿脓菌素的合成会增加，而在绿脓杆菌中表达P19突变体蛋白时其绿脓菌素的合成会减少。
[0014]具体地，所述在绿脓杆菌中表达P19蛋白或表达P19突变体蛋白是通过构建重组表达载体再导入绿脓杆菌中实现的。
[0015]本专利技术还申请保护香石竹意大利环斑病毒P19突变体蛋白在防治绿脓杆菌或在制备防治绿脓杆菌的药物中的应用。
[0016]具体地，所述P19突变体蛋白的突变方式为点突变，突变位点为P19蛋白氨基酸序列的第71和72位。
[0017]具体地，所述点突变的P19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0018]具体地，编码所述点突变的P19蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0019]具体地，构建重组表达载体时所用载体为PJN105表达载体。
[0020]实验发现，其它表达载体也可以实现同样的效果。
[0021]本专利技术具有以下有益效果：
[0022]本专利技术通过构建香石竹意大利环斑病毒P19蛋白的重组表达载体并转入绿脓杆菌中发现，在绿脓杆菌中表达P19蛋白时其绿脓菌素的合成会增加，而在绿脓杆菌中表达P19突变体蛋白时其绿脓菌素的合成会减少，表明该蛋白可以调控绿脓菌素的合成影响绿脓杆菌的毒力，进而可将其用于防治绿脓杆菌，为绿脓杆菌的防治提供了新方法。
附图说明
[0023]图1为调控绿脓杆菌合成绿脓菌素的重组表达载体的设计示意图。
[0024]图2为大肠杆菌阳性转化子的PCR检测结果。
[0025]图3为绿脓杆菌中重组表达载体的PCR检测结果。
[0026]图4为P19蛋白及其突变体蛋白在绿脓杆菌中的表达结果。
[0027]图5为P19蛋白转化子及P19突变体蛋白转化子中绿脓菌素的检测结果。
具体实施方式
[0028]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0029]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0030]实施例1重组表达载体的构建及筛选
[0031]本专利技术分别构建了香石竹意大利环斑病毒P19蛋白的重组表达载体及其突变体蛋白的重组表达载体。所述P19蛋白突变体的突变位点为P19蛋白的第71和72氨基酸位点，此突变使得P19的功能改变。所述P19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码P19蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述P19蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编
码P19蛋白突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0032]本专利技术所用表达载体为PJN105，所述载体中含有组氨酸标签和阿拉伯糖诱导的操纵子。添加组氨酸标签以便后期将P19蛋白提取出来，而阿拉伯糖的操纵子有利于在加入阿拉伯糖后，诱导P19蛋白大量表达。所述重组表达载体的设计示意图如图1所示，由图1可知，重组表达载体中阿拉伯糖操纵子，RBS序列和6个组氨酸抗体标签的位置，此外还包括限制性酶切位点的选择。
[0033]具体步骤如下：
[0034]1、PCR扩增DNA片段
[0035]为方便后期将P19蛋白提取出来，故本专利技术在构建重组表达载体时，在P19蛋白及其突变体蛋白中添加了6个组氨酸(His抗体标签)。本专利技术通过设计引物，将6个组氨酸的DNA序列插入到P19序列的ATG后面。而P19突变体蛋白的具体突变位点位于基因的中间部分，故本专利技术通过设计引物将突变的位点设计在引物上，然后通过PCR扩增引入突变位点，构建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.香石竹意大利环斑病毒P19蛋白在调控绿脓杆菌毒力中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用为香石竹意大利环斑病毒P19蛋白通过调控绿脓杆菌绿脓菌素合成在调控绿脓杆菌毒力中的应用。3.香石竹意大利环斑病毒P19突变体蛋白在防治绿脓杆菌或在制备防治绿脓杆菌的药物中的应用。4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述P19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，编码所述P19蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在绿脓杆菌中表达P19蛋白时其绿脓菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴伟君，蔡文杰，卢铭琪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：