一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物及其应用制造技术

本申请属于仿生纳米药物制备技术领域，具体涉及一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物及其应用的专利申请。该仿生纳米药物通过：以血管内皮细胞HUVEC膜制备仿生纳米载体HNPs、修饰改造B7

【技术实现步骤摘要】
一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物及其应用


[0001]本申请属于仿生纳米药物制备
，具体涉及一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物及其应用的专利申请。

技术介绍

[0002]肿瘤防治中，现有治疗方案大多仅针对肿瘤细胞本身，而肿瘤细胞（癌细胞）的转移则是影响肿瘤防治效果的重要影响因素。研究认为，肿瘤转移的关键步骤是循环肿瘤细胞在次要或远处器官成功定植，但此步骤受到远处器官局部微环境的影响。为此，肿瘤细胞可通过分泌细胞因子和细胞外囊泡等方式改变远处器官的局部微环境（即转移前微环境），为肿瘤细胞在远端转移器官的定植和生长做“准备”。基于此特点，针对转移前微环境的深入研究，是改善相关肿瘤（癌）防治的重要突破点之一。
[0003]研究表明，肝转移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一。在此过程中，肝星形细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活对于转移前微环境形成的初始阶段有着重要的作用。其通过分泌大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM），包括胶原蛋白I和纤连蛋白等成分，介导肝纤维化，调控转移前微环境以促进肿瘤细胞的粘附和定植。也即，HSCs被激活后所介导的肝纤维化对于胰腺癌肝转移的发展形成至关重要。基于这一特点，靶向抑制HSCs的激活即有可能抑制胰腺癌肝转移发生，从而为相关肿瘤（癌）的防治奠定一定基础。
[0004]现有技术中，松弛素作为一种肽类激素，临床上多被用于治疗急性心力衰竭的肽类激素，而对其作用机理研究认为，其具有较强的抗纤维化作用，其主要机制为：松弛素与可与松弛素受体1结合，进而抑制促纤维化因子（如：TGF
‑
β）诱导的Smad2/3磷酸化，最终可以抑制胶原的沉积及相关诱导基质的降解。由于肝星形细胞表面表达有松弛素受体1，因此，部分研究表明，松弛素可抑制肝星形细胞激活后所介导的纤维化过程。但由于松弛素的分子结构中富含二硫键，使得其人工合成制备工艺复杂、制备成本较高，因此一定程度上限定了其实际的临床推广应用。
[0005]需要说明的是，多肽B7
‑
33作为一种仅有B链结构的松弛素类似物，其具有与松弛素类似的抗纤维化作用，而鉴于其具有易于合成、易于修饰、免疫原性低等特点，因此有望替代松弛素的临床应用。但由于多肽B7
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33静脉给药的半衰期仅为数分钟，因此，如何增加B7
‑
33的体内半衰期且保留其最大生物利用度是改善多肽B7
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33应用效果的最大技术挑战之一。此外，由于B7
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33全身性给药的靶部位递送效率极低，因此，如何改善B7
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33应用过程中的靶向性，也是改善提高B7
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33应用效果的关键。
[0006]近年来，以生物膜为代表的仿生纳米载体技术的快速发展，因具有天然的体内长循环和良好的生物相容性等特点，为改善相关药物分子的递送效果提供了一种新的技术思路。同时，随着生物肽改造来改善其半衰期和生物利用度技术的成熟，因此，将相关治疗性多肽药物分子与纳米仿生载体技术相结合，设计一种靶向能力强、递送效率高的体内递送系统，对于改善相关疾病的防治效果具有积极的技术意义。

技术实现思路

[0007]基于血管内皮细胞（HUVEC）制备仿生纳米载体和对B7
‑
33的修饰改造，本申请目的在于提供一种可以逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物，从而可为胰腺癌肝转移的防治奠定一定技术基础，进而可为改善和提高胰腺癌的防治效果奠定基础，同时也可为其他肿瘤（癌）的防治提供一定借鉴和参考。
[0008]本申请所采取的技术方案详述如下。
[0009]一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物，其通过如下步骤制备获得：（一）制备仿生纳米载体以血管内皮细胞（HUVEC）膜制备仿生纳米载体HNPs，所述血管内皮细胞膜，可采用经典的细胞膜提取方法制备获得，具体操作而言，参考如下：（1）梯度离心提取获得细胞膜将预先培养长满培养皿的血管内皮细胞中的培养液倒掉，PBS轻洗3遍后（最后一遍清洗时保留1ml的PBS），刮下细胞，1000r离心5min；弃上清，向细胞沉淀中加IB
‑
1（2ml）重悬，转入玻璃匀浆器中研磨40下左右（冰上操作）；将研磨后的细胞液，4℃、3000g离心5min，留上清；将上清再4℃、10000g离心10min，留上清；将上清加到超离管中，加IB
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1补满，4℃、10000g离心2h，留沉淀（直接进行后续操作或
‑
80
°
C保存备用）。
[0010]所述IB
‑
1（isolation buffer，需要现配现用），为：SB + 0.5%BSA + 0.5mmolEGTA，配制时：先将0.5g BSA溶解于100ml的SB溶液中，再加入500ul 100mmol EGTA（pH7.4），和加入1%蛋白酶抑制剂；所述蛋白抑制剂，DMSO配制，各物料浓度为：200mM AEBSF、30μM Aprotinin、13mM Bestatin、1.4mM E64和1mM Leupeptin；所述SB（提前一天配制），为：225mmol甘露醇 + 75mmol蔗糖+ 30mmol Tris
‑
HCl（pH 7.4）；配制时：先将20.5g甘露醇和13g蔗糖溶解于400ml ddH2O中，再加入15ml Tris
‑
HCl中，4
°
C放置30min，调pH=7.4，最后用ddH2O定容至500ml。
[0011]（2）使用挤出器挤成细胞膜仿生型纳米载体HNPs将步骤（1）中离心所得血管内皮细胞置于细胞超声破碎仪中，超声功率100w超声处理3min（超声5s，暂停5s），随后，采用Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids)挤出器进行挤出操作：首先，利用0.8 μm 聚碳酸酯 (PC) 膜，对超声处理后血管内皮细胞膜进行上下挤出10次；随后，依次使用0.4 μm和0.1 μm的PC膜分别进行上下挤出10次处理；最后，制备成平均粒径100nm左右的均一性纳米颗粒（仿生纳米载体HNPs）备用；（二）B7
‑
33的修饰改造将RGD序列与B7
‑
33偶联修饰（RGD
‑
B7
‑
33）；所述多肽B7
‑
33，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL；修饰改造后的B7
‑
33（RGD
‑
B7
‑
33）的氨基酸序列为：VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL
‑
GG
‑
c(RGDfK)；所述RGDfK即为：Arg
‑
Gly
‑
Asp
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物，其特征在于，该仿生纳米药物通过如下步骤制备获得：（一）制备仿生纳米载体以血管内皮细胞HUVEC膜制备仿生纳米载体HNPs，（二）B7
‑
33的修饰改造将RGD序列与多肽B7
‑
33偶联修饰；所述多肽B7
‑
33，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL；修饰改造后的B7
‑
33的氨基酸序列为：VIKLSGRELVRAQIAISGMSTWSKRSL
‑
GG
‑
c(RGDfK)；（三）装载构建多肽仿生纳米药物基于受体和配体的亲和性，实现多肽B7
‑
33在仿生纳米载体HNPs上的高效装载，构建获得多肽仿生纳米药物B7
‑
33
‑
HNPs；具体操作而言：将步骤（二）的修饰改造后的B7
‑
33与步骤（一）制备所得仿生纳米载体HNPs混合孵育，即可制备获得仿生纳米药物B7
‑
33
‑
HNPs。2.如权利要求1所述逆转肝星形细胞激活的仿生纳米药物，其特征在于，步骤（一）中，所述血管内皮细胞膜，采用细胞膜提取方法制备获得，具体操作为：（1）梯度离心提取获得细胞膜收集所培养的血管内皮细胞，用IB
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：