古菌酪氨酰-tRNA合成酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了古菌酪氨酰

【技术实现步骤摘要】
古菌酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶工程
，尤其涉及古菌酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]酶作为一种重要的生物催化剂，具有催化效率高、专一性强且反应条件温和等优势，因此被广泛地应用于医药、分析检测、工农业生产等领域。但同时酶也存在热稳定性差，底物普适性较差，对有机溶剂的耐受性较差以及酶可催化的反应类型较少等缺点，这限制了酶在大规模工业生产中的应用。定向进化技术的兴起，实现了对酶性质的改造与进化，大大改善了上述问题，促进了酶在化合物合成上的应用。
[0003]目前，基因点突变，组合突变，计算机辅助蛋白设计以及化学修饰等方法能够赋予蛋白一些新的功能，但这些方法都依赖于20种天然氨基酸本身，其功能基团仅有氨基、羟基、巯基、羧基等少数几种，功能有限。非天然氨基酸(ncAA)含有乙酰基、炔基、硝基、卤代物、叠氮基、醛基、酮基等多种基团，可进行多种修饰反应，如糖基化、光化学以及荧光显示等反应，这可以极大地拓展了蛋白质的结构和功能。另外，具有活性基团的ncAA可以广泛地应用于蛋白质结构研究、蛋白质功能调控以及新型生物材料构建和医药研发等诸多领域。
[0004]常用的引入ncAA的方法是遗传密码扩展(GCE)技术，其核心是氨酰
‑
tRNA合成酶(aminoacyl
‑
tRNA synthetase，aaRS)，它能够将ncAA整合到核糖体上的蛋白质中，使得在蛋白质合成中可控地引入ncAA。GCE技术的关键是特定密码子对应的ncAA与正交的tRNA/aaRS之间一一的对应关系。体内密码子拓展需要满足三个条件：(1)在所需位点特异性地引入一个未被用于编码其他氨基酸的空白密码子，通常为琥珀终止密码子UAG；(2)一个不被内源性aaRS识别的正交的tRNA，可以在翻译过程中识别并编码空白密码子；(3)一个不与内源性的tRNA相互作用，并且被改造为与ncAA相互作用，从而识别并引入ncAA而非内源性天然氨基酸的氨酰
‑
tRNA合成酶。
[0005]过去十年间，基于GCE的蛋白质内非天然氨基酸引入技术得到了迅速的发展及应用，其在治疗蛋白领域的应用包括抗体药物偶联(ADC)、双特异性抗体(BsAb)、免疫治疗、治疗疫苗、长效蛋白质治疗、治疗蛋白的修饰以及其他与治疗相关的应用。此外，ncAA可以作为探针来研究蛋白质结构与功能，比如一些光控ncAAs如邻
‑
硝基苄基
‑
L酪氨酸o
‑
nitrobenzyl
‑
O
‑
L
‑
tyrosine(ONBY)，经过一定波长的光照后可以发生分解反应形成与之类似的天然氨基酸。这一特性决定了该类ncAA可以作为光响应元件，实现对酶功能的光控制。另外，将ncAA引入到酶中还可提高酶的催化活性、立体选择性以及热稳定性等。
[0006]虽然基因密码子扩展技术已经得到了成功应用，但是现有的大多数非天然氨基酸引入效率较低，这主要是因为改造过的氨酰
‑
tRNA合成酶催化tRNA和相应ncAA发生氨酰化反应的效率不高，导致含有ncAA的重组蛋白的表达量较低，这大大限制了其在蛋白质结构及功能研究与改造中的应用，且提高了工业应用成本。因此对tRNA/氨酰
‑
tRNA合成酶进行改造，增强ncAAs在目标蛋白质内的引入效率，提高含ncAAs的重组蛋白表达量，对于基础研究以及工业生产都至关重要。

技术实现思路

[0007]为解决非天然氨基酸引入效率不高的问题，本专利技术提供了一种定点突变改造的古菌酪氨酰
‑
tRNA合成酶(MjTyrRS)突变体，该突变体可以实现在目标蛋白质中高效引入多种非天然氨基酸。
[0008]具体技术方案如下：
[0009]酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体，由来自詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)的野生型酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变所得，具体突变为以下任意一种：
[0010](1)283位的组氨酸突变为苏氨酸，284位脯氨酸的突变为丝氨酸，285位的甲硫氨酸突变为天冬氨酸，且286位的天冬氨酸突变为缬氨酸；
[0011](2)283位的组氨酸突变为苏氨酸，285位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，且286位的天冬氨酸突变为亮氨酸；
[0012](3)283位的组氨酸突变为赖氨酸，285位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，且286位的天冬氨酸突变为亮氨酸。
[0013]优选的，所述野生型酪氨酰
‑
tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0014]本专利技术通过对来源于M.jannaschii的酪氨酰
‑
tRNA合成酶pCNPheRS的tRNA的结合区域进行改造，选取与tRNA C34(原G34)位点相近的283，285以及286三个位点进行饱和突变，其中pCNPheRS是在MjTyrRS的基础上对催化区域进行改造获得的，其提高了对非天然氨基酸的引入效率。另外对283
‑
286四个位点进行定点突变，构建并获得了活性提高的突变体，实现了多种ncAAs在目标蛋白中的引入。
[0015]本专利技术还提供了一种所述酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体的编码基因。
[0016]本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。
[0017]本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。
[0018]本专利技术还提供了所述酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体、或者所述的编码基因在向目标蛋白质引入非天然氨基酸中的应用。
[0019]进一步地，所述应用包括：将所述重组载体与目标蛋白质粒共转化至感受态细胞中进行诱导培养，得到含非天然氨基酸的目标蛋白。
[0020]进一步地，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0021]进一步地，所述非天然氨基酸为4
‑
氨基
‑
L
‑
苯丙氨酸，4
‑
硝基
‑
L
‑
苯丙氨酸、3
‑
(4
‑
乙酰苯基)丙氨酸、L
‑4‑
氰基苯丙氨酸、4
‑
甲氧基
‑
L
‑
苯丙氨酸、L
‑4‑
氟苯丙氨酸、O
‑
叔丁基
‑
L
‑
酪氨酸、O
‑
苄基
‑
L
‑
酪氨酸中的至少一种。
[0022]本专利技术还提供了一种在目标蛋白质中引入非天然氨基酸的方法，将所述重组载体与蛋白质质粒共转化至感受态细胞中进行诱导培养，得到含非天然氨基酸的蛋白质。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.古菌酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体，其特征在于，由来自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)的野生型酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变所得，具体突变为以下任意一种：(1)283位的组氨酸突变为苏氨酸，284位的脯氨酸突变为丝氨酸，285位的甲硫氨酸突变为天冬氨酸，且286位的天冬氨酸突变为缬氨酸；(2)283位的组氨酸突变为苏氨酸，285位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，且286位的天冬氨酸突变为亮氨酸；(3)283位的组氨酸突变为赖氨酸，285位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，且286位的天冬氨酸突变为亮氨酸。2.如权利要求1所述的古菌酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体，其特征在于，所述野生型酪氨酰
‑
tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。3.如权利要求1或2所述的古菌酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体的编码基因。4.一种包含权利要求3所述编码基因的重组载体。5.一种包含权利要求3所述编码基因的基因工程菌。6.如权利要求1或2所述的古菌酪氨酰
‑
tRNA合成酶突变体、或者如权利要求3所述的编码基因在向目标蛋白质引入非天然氨基酸中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：于浩然，陈婉姨，李新佳，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：