用于产生趋化因子受体抗体的硫酸化肽制造技术

本发明专利技术涉及用于产生特异性结合趋化因子受体(例如CC或CXC趋化因子)的抗体的工具和方法。本发明专利技术提供了分离的硫酸化多肽及其缀合物，其可例如用作抗原或用于脱靶淘选，以促进抗人、抗食蟹猴和/或抗小鼠趋化因子受体抗体的产生，例如用于产生具有完全人CDR和/或其他用于治疗用途的有利性质的抗体。本发明专利技术还涉及可通过应用上述工具和方法获得的抗体及其缀合物。提供了特异性结合人、食蟹猴和/或鼠CCR8的抗体，其具有用于治疗用途的有利性质，例如交叉反应性抗体、完全人抗体、低内化(包括非内化)抗体和在Treg细胞中有效诱导ADCC和/或ADCP的抗体。还提供了本发明专利技术抗体或缀合物的医学用途和/或治疗方法，其包括单独或组合地向患者或受试者施用这些抗体。最终提供了生物标志物、分层方法和诊断方法来预测或评估抗CCR8抗体单一疗法或组合疗法的响应性。本发明专利技术还提供了用于生产上述抗体的工具和方法、药物组合物、抗体的诊断用途以及带有使用说明书的试剂盒。盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生趋化因子受体抗体的硫酸化肽


[0001]本专利技术涉及用于产生特异性结合趋化因子受体如CC或CXC趋化因子受体的抗体的工具和方法。提供了分离的硫酸化多肽及其缀合物，其可用作例如抗原或用于脱靶淘选以促进抗人、抗食蟹猴和/或抗小鼠趋化因子的产生，例如用于产生具有完全人CDR和/或其他有利特性以用于治疗用途的抗体。
[0002]本专利技术还涉及可通过应用上述工具和方法获得的抗体及其缀合物。提供了特异性结合人、食蟹猴和/或鼠CCR8并具有有利特性用于治疗用途的抗体，例如交叉反应抗体、全人抗体、低内化(包括非内化)抗体、和在Treg细胞中有效诱导ADCC和/或ADCP的抗体。
[0003]还提供了本专利技术抗体或缀合物的医学用途和/或治疗方法，包括将这些抗体单独或组合施用给患者或受试者。最终提供了生物标志物、分层方法和诊断方法来预测或评估对抗CCR8抗体单一疗法或组合疗法的响应。
[0004]本专利技术还提供了用于产生前述抗体的工具和方法、药物组合物、抗体的诊断用途以及带有使用说明书的试剂盒。
[0005]技术问题
[0006]产生CC和CXC趋化因子受体的抗体
[0007]CXC和CC趋化因子受体是特定的七次跨膜G蛋白偶联受体，可介导趋化梯度中的细胞迁移。由于其固有的结构、生物物理和生物学特性，趋化因子受体是抗体生成的具有挑战性的目标类别。难以获得针对趋化因子受体的最佳抗体的原因有多种，这将以示例性方式进行讨论，重点放在人CCR8上。
[0008]趋化因子受体的特点是嵌入细胞膜中的七个结构域，因此在其天然确认中不易纯化。纯化的天然趋化因子受体将从膜环境中移除，因此可能在构象上受到损害。这些损坏的结构通常不适合抗体生成，因为抗体需要识别呈现在细胞表面的完整抗原。虽然一些趋化因子受体，如CXCR4和CCR5，具有一些固有的稳定性，允许在温和的洗涤剂中纯化，但这不适用于大多数趋化因子受体(Hutchings，Catherine J.，et al.
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Opportunities for therapeutic antibodies directed at G
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protein
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coupled receptors.
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Nature reviews Drug discovery 16.11(2017)：787.)。事实强调了这一点，直到今天，蛋白质数据库PDB(rcsb.org)中还没有可用于CCR8的X射线晶体结构。
[0009]因此，对于趋化因子受体来说，为了获得天然构象中所需数量的蛋白质以及正确的方向和折叠以用作免疫原而进行增溶是很困难的(参见cf.Klarenbeek，Alex，et al.
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Targeting chemokines and chemokine receptors with antibodies.
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Drug Discovery Today：Technologies 9.4(2012)：e237
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e244.)。
[0010]人CCR8整体结构的示意图如图2b所示。在355个氨基酸中，残基1
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35(N端)、94
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107(ECL1)、172
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202(ECL2)和264
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280(ECL3)被预测为细胞外结构域(uniprot.org)。假设这些细胞外结构域采用三级结构，由二硫键稳定。因此，平均不到30％的趋化因子受体暴露在细胞表面。因此，趋化因子受体尤其是CCR8不易接近抗体结合，如WO200744756中所述。
[0011]此外，针对对应于趋化因子受体细胞外结构域的肽产生的抗体通常无法识别细胞
上的完整受体，这可能是由于二级结构的差异。因此，该领域的研究人员在开发抗体方面的成功率很低(Tschammer，Nuska，ed.Chemokines：chemokines and their receptors in drug discovery.Vol.14.Springer，2015，Chapter by J.E.Pease＆R.Horuk，section 6，page 12，2nd para)。
[0012]获得抗鼠CCR8抗体的抗体生成似乎稍微不那么困难，专利技术人可以复制传统方法，例如Kremer和M
á
rquez描述的方法(D
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Ambrosio，Daniele，and Francesco Sinigaglia.Cell Migration in Inflammation and Immunity.Springer，2004.，Chapter by Kremer and M
á
rquez p.243
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260)。鼠和人CCR8的序列同一性约为70％，对于细胞外结构域而言甚至更低，如实施例2中更详细的描述。然而，Kremer和M
á
rquez讨论，抗小鼠趋化因子受体单克隆抗体的产生是一项艰巨的挑战，尽管自首次报道其氨基酸序列以来已经过去了一段时间，但针对小鼠趋化因子受体的抗体却相对稀少。
[0013]CCR8的治疗性抗体及其医药用途
[0014]尽管它们的产生存在困难，但靶向CC趋化因子受体的抗体已被建议作为各种疾病的有前途的治疗工具，例如基于对涉及免疫细胞的疾病或以趋化因子受体异常表达为特征的各种癌症适应症的机制洞察。
[0015]2004年，Curiel等可以显示对于104名卵巢癌患者的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(Treg细胞或Tregs)，人肿瘤Treg细胞抑制肿瘤特异性T细胞免疫并促进体内人类肿瘤的生长(Curiel，Tyler J.，et al.
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Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.
″
Nature medicine 10.9(2004)：942
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949.)。
[0016]肿瘤细胞和微环境巨噬细胞产生趋化因子，例如CCL22，它介导Treg细胞向肿瘤的运输。肿瘤微环境中高水平的Tregs不仅与许多癌症(如卵巢癌、乳腺癌、肾癌和胰腺癌)的预后不良有关，而且会抑制针对这些癌症的免疫应答，例如通过抑制免疫系统效应细胞的作用。因此，Treg细胞的这种特异性募集代表了肿瘤可以促进免疫特权的一种机制。因此，有人建议阻断Treg细胞迁移或功能以战胜人类癌症。
[0017]意识到Curiel的发现后，围绕Plitas/Rudensky和De Simone/Abrignani/Pagani的两个独立团队发现肿瘤浸润性Treg细胞的特征在于CCR8的选择性表达。事实上，对于肿瘤浸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的多肽或其缀合物，其中所述分离的多肽包含七次跨膜受体的富含酪氨酸的结构域(TRD)，其进一步的特征在于至少25％、至少50％或至少75％的TRD的酪氨酸残基被硫酸化。2.根据权利要求1所述的分离的多肽或缀合物，其中所述七次跨膜受体是人、食蟹猴和/或小鼠。3.根据权利要求1或2所述的分离的多肽或缀合物，其中所述七次跨膜受体是趋化因子受体，优选地a.CC趋化因子受体，例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9或CCR10，b.CXC趋化因子受体，例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5或CXCR6，或CX3CR1或CXCR1。4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的多肽或缀合物，其中所述七次跨膜受体是CCR8。5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的多肽或缀合物，其中所述分离的多肽包含含有TRD和LID结构域的所述七次跨膜受体的N端，优选地其中在所述TRD和所述LID结构域之间的至少一个半胱氨酸已被移除或已被改变成不同的氨基酸。6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的多肽或缀合物，其中所述多肽包含以下序列或与以下序列具有至少90％序列同一性的序列：a.SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46或SEQ IDNO:47，优选地其中Y3、Y15和Y17中的至少两个或全部已被硫酸化，或b.SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48，优选地其中Y3、Y14和Y15中的至少两个或全部已被硫酸化，或c.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6，优选地其中至少Y10和/或Y18已被硫酸化，或d.SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:11，优选地其中至少Y26已被硫酸化，或e.SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12，优选地其中至少Y37和/或Y39已被硫酸化，或f.SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16，优选地其中Y16和/或Y17已被硫酸化，或g.SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:17，优选地其中Y16已被硫酸化，或h.SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18,优选地其中Y20和/或Y22已被硫酸化，或i.SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24，优选地其中至少Y22已被硫酸化并且还优选地Y16、Y19和/或Y20已被硫酸化，或j.SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:29，优选地其中Y3、Y10、Y14和Y15中的两个、三个或全部已被硫酸化，或k.SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:30，优选地其中Y10、Y12和Y16中的两个或三个已被硫酸化，或l.SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:34，优选地其中Y18、Y26和Y27中的至少两个或三个已被硫酸化，或m.SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:35，优选地其中Y23、Y31和Y32中的至少两个或三个已被硫酸化，或
n.SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36，优选地其中Y13、Y18和Y19中的至少两个或三个已被硫酸化，或o.SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:41，优选地其中Y8和Y17的一个或两个已被硫酸化，或p.SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:42，优选地其中Y8和Y17之一或两者以及任选地Y20已被硫酸化，或q.SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:62或SEQ IDNO:65，优选地其中至少Y28，并且还优选地Y17和/或Y37已被硫酸化，或r.SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:66，优选地其中至少Y28已被硫酸化，并且还优选地Y19已被硫酸化，或s.SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:68或SEQ IDNO:71，优选地其中Y14和Y22中的至少一个或两个已被硫酸化，或t.SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:72，优选地其中Y14、Y17和Y22中的至少一个、两个或全部已被硫酸化，或u.SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:76，优选地其中Y27已被硫酸化，或v.SEQ ID NO:74或S...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：拜耳公司，
类型：发明
国别省市：