【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开内容一般涉及分子生物学领域，具体涉及用于基因编辑的新型核酸酶。
技术介绍
1、在过去几年中，使用crispr(成簇规律间隔短回文重复序列)-cas(crispr相关蛋白)的rna引导的dna靶向原理编辑基因组已被广泛应用。已经描述了三种类型的crispr-cas系统(i型、ii型和iib型、iii型和v型)。用于基因组编辑的crispr-cas的大多数用途都是使用ii型系统。细菌ii型crispr-cas系统提供的主要优势在于对可编程dna干扰的最低要求：由可定制的双rna结构引导的核酸内切酶cas9。如在化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)的原始ii型系统中最初证明的那样，反式激活的crispr rna(tracrrna)与前体crispr rna(pre-crrna)的不可变重复序列(invariable repeat)结合，以形成双rna，该双rna对于在cas9存在下通过rnase iii的rna共成熟和通过cas9切割入侵dna都是必需的。如在化脓性链球菌中所证明的，cas9在成熟激活tracrrna和靶向crrna之间形成的双链体(duplex)引导下，在入侵的同源dna中引入位点特异性双链dna(dsdna)断裂。cas9是一种多结构域酶，它使用hnh核酸酶结构域来切割靶标链(target strand)(定义为与crrna的间隔区序列(spacer sequence)互补)和ruvc样结构域(ruvc-iike domain)来切割非靶标链(non-target strand)。核酸酶
2、研究表明，rna引导的cas9可以在多种细胞(包括原核生物和真核生物(包括人)的细胞)中用作基因组编辑工具。该系统是多功能的，通过对cas9进行编程，使用多个向导rna同时编辑基因组中的多个位点，从而实现多重基因组工程(multiplex genomeengineering)。cas9转化为切口酶被证明有助于哺乳动物基因组中同源定向修复，同时降低诱变活性。此外，例如，cas9催化失活突变体的dna结合活性已被用于设计rna可编程转录沉默和激活装置或表观遗传修饰物(epigenetic modifier)。
3、哺乳动物细胞中的基因组编辑部分受到cas9蛋白尺寸的限制。来源于化脓性葡萄球菌的cas9(spycas9)是迄今为止使用最广泛的酶，包含约4.2kb的dna(wo2013/176722)，与同源单链向导rna(single guide rna，sgrna)的直接组合进一步增加了尺寸。腺相关病毒是在基因治疗应用中用于递送cas9酶的载体之一。然而，aav负载尺寸(cargo size)被限制在约4.5kb。由于尺寸限制，递送cas9及其sgrna和潜在dna修复模板可能会成为使用该方法的障碍。更小的cas9分子已经被表征，但它们中大多数都存在原型间隔区相邻基序(pam)序列不如spycas9所使用的原型间隔区相邻基序定义得那么明确的问题。例如，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(saucas9使用“nngrr(t)”序列，其中r＝a或g，空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)(cja)cas9分别使用“nnnacac”/“nnnryac”pam(其中y＝t或g)(j.biol.chem.,vol.295,issue 19,2020,pp 6509-6517)。pam的模糊性增加了该酶在与pam具有高度或完美序列同一性的脱靶序列(off-target sequence)上产生不希望的活性的可能性。这些系统的特异性仍然令人担忧，因为意外地靶向类似位点(“脱靶”)会增加不良事件的可能性。
4、现有的crispr-cas 9系统通常具有以下一个或多个缺点：
5、a)它们的尺寸太大，以至于无法在已建立的适合治疗的病毒递送系统的基因组中携带，如腺相关病毒(aav)。
6、b)它们中的许多在非宿主环境中(例如，在真核细胞中，特别是在哺乳动物细胞中)基本上没有活性。
7、c)当间隔区和原型间隔区序列之间存在错配时，它们的核酸酶可以催化dna链切割，导致不希望的脱靶效应，例如使它们不适合基因治疗用途或需要高精度的其他应用。
8、d)它们可能会激发免疫应答，从而限制其在哺乳动物体内的应用。
9、e)它们需要复杂和/或长的pam，这限制了dna靶向区段的靶标选择。
10、f)它们在质粒或病毒载体中表现出较差的表达。
技术实现思路
1、本专利技术涉及改进的和工程化的crispr cas核酸酶(smallcas9)，其基于小crisprcas9核酸酶，如金黄色葡萄球菌的crispr cas 9核酸酶(m-saucas9)(ncbi refseq idj7rua5.1)和类似的crispr cas核酸酶(一般是m-smallcas9，其具有显著改进的pam需求(例如，与saucas9的“nngrr(t)”相比的“nngg”)(j.biol.chem.,vol.295,issue 19,2020,pp 6509-6517)，从而保持核酸酶的高活性。通过引入一个或一些选择的氨基酸交换，可以容易地优化野生型酶的pam选择性，由此通常酶的活性一般不受影响。
2、本专利技术的一个具体实施方案是选自以下的多肽：
3、seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5，或与上述任何多肽具有至少95％同一性的任何多肽序列，条件是该多肽具有以下称为saucas 9的氨基酸残基，而saucas9中位置前面的氨基酸表征了该多肽中必须存在的氨基酸；
4、或者选自以下的多肽：
5、seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5，或与上述任何任何多肽具有至少95％同一性的任何多肽序列，条件是与来自金黄色葡萄球菌的cas9序列(ncbi refseq id j7rua5.1)相比，该多肽包括以下氨基酸置换，而saucas9中位置前面的氨基酸表征了该多肽中必须存在的氨基酸；
6、(i)seq id no:1的i1017k、p1013e、r991m
7、(ii)seq id no:2的i1017k、p1013e、r991m、l989r
8、(iii)seq id no:3的i本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽，其选自：
2.一种多肽，其选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5。
3.一种多肽，其选自：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
4.根据SEQ ID NO:5所述的多肽。
5.一种组合物，其包含
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述工程化的DNA靶向区段在其3'末端与PAM序列直接相邻，或者这样的PAM序列在其3’部分是DNA靶向序列的一部分。
7.在细胞中或体外的一个或多个位置靶向、编辑、修饰或操纵靶DNA的方法，所述方法包括
8.组合物用于在细胞中或体外的一个或多个位置靶向、编辑、修饰或操纵靶DNA的用途，所述组合物包含
9.一种细胞，其包含
10.一种试剂盒，其包含
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种多肽，其选自：
2.一种多肽，其选自：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq idno:5。
3.一种多肽，其选自：seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5。
4.根据seq id no:5所述的多肽。
5.一种组合物，其包含
6.根据权利要求5所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·科宁，F·里奇特，A·尼林克斯，
申请(专利权)人：拜耳公司，
类型：发明
国别省市：
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