用于制备寡核苷酸的方法技术

披露了用于制备寡核苷酸的方法。该方法包括：(a)将具有式X

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备寡核苷酸的方法


[0001]本披露总体上涉及用于制备寡核苷酸(如磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO))的方法。

技术介绍

[0002]磷酰二胺吗啉代寡聚物(或PMO)是核酸类似物，其紧密地且序列特异性地与互补RNA结合，并可用于调节蛋白质合成并因此调节基因表达。这些寡聚物由吗啉代骨架系统支撑的碱基配对识别部分(杂环碱基)构成。用于合成这样的寡聚物的吗啉代亚基可以容易地从相应的核糖核苷制备，这些核糖核苷是容易获得且廉价的前体。
[0003]在这样的合成期间，如在常规寡核苷酸合成中那样，典型地掩蔽杂环碱基上的官能团以防干扰合成转化。
[0004]已知O6未受保护的鸟嘌呤亚基在寡聚物阶段引起副反应。例如，O6氧可以在偶联步骤期间与激活的亚基反应，形成O6磷酸化的或衍生的物质，并且在用氨最终切割碱基保护基团期间，氨可以在C6处反应以置换这些物质，得到二氨基嘌呤衍生物。这样的杂质难以通过色谱法去除，并且导致产率的大幅损失。
[0005]本领域已经提出了多种保护方案以减少常规寡核苷酸合成中未受保护的鸟嘌呤O6位置的副反应。然而，当应用于磷酰二胺吗啉代寡聚物合成时，这些方案基本上不成功。因此，需要改善的方法来提高磷酰二胺吗啉代寡聚物合成(特别是在使用G吗啉代亚基时)的产率和纯度。
[0006]总结
[0007]由于吗啉代化学的特别挑战，碱基保护基团应满足几个要求。保护基团应易于引入到杂环部分上并且此后对亚基激活和纯化条件以及固相合成是稳定的。保护基团不应与生长链的吗啉代胺部分反应，并应允许激活的吗啉代亚基与生长的寡聚物链干净地偶联。保护基团应在不引入新杂质的情况下优选地由氨切割。最后，保护基团应产生结晶亚基衍生物以避免在激活之前需要色谱纯化。
[0008]如US 2009/0131624 A1中所述，O6位置处的4
‑
硝基苯乙基(NPE)基团不充分满足这些标准。用碱性试剂经由β
‑
消除机制切割NPE基团。这些条件倾向于生成反应性副产物4
‑
硝基苯乙烯，然后该4
‑
硝基苯乙烯可以与寡聚物上的反应性位点反应。虽然将各种清除剂(例如，硫醇和1,3
‑
二羰基化合物)引入脱保护混合物中以试图防止寡聚物捕获副产物，但没有一种完全成功地消除了这种内部回流问题。即使在纯化后，用该亚基制备的寡聚物也呈黄色。在各个实施例中，本披露提供了可用于解决这些问题中的一个或多个问题的方法和工艺。
[0009]在一个方面，本披露提供了用于制备寡核苷酸(如磷酰二胺吗啉代寡聚物(“PMO”))的方法。
[0010]在另外的方面，本披露提供了可用于制备固相支持的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法和组合物。
[0011]本文所述的PMO的合成方法在许多方面是有利的，包括但不限于提高了目标磷酰
二胺吗啉代寡聚物的产率和纯度，同时减少了4
‑
硝基苯乙烯加合物杂质。
[0012]当阅读本披露的以下具体实施方式时，本披露的这些和其他目的和特征将变得更加显而易见。
具体实施方式
[0013]示例性寡核苷酸合成方法
[0014]本披露提供了一种用于制备寡核苷酸的方法，该方法包括：
[0015](a)将具有式X
‑
1的化合物转化为具有式X
‑
2的化合物：
[0016][0017]其中：
[0018]R
10
是起始寡核苷酸(例如，磷酰二胺吗啉代寡聚物)的残基；
[0019]R
11
是胺保护基团；
[0020]优选地，具有式X
‑
1的化合物不与固体支持物结合；以及
[0021](b)任选地去除该具有式X
‑
2的化合物中的保护基团以获得该寡核苷酸。
[0022]本领域技术人员应当清楚，式X
‑
1和X
‑
2中的R
10
可以是相同的或不同的，这取决于式X
‑
1中起始寡核苷酸(例如，磷酰二胺吗啉代寡聚物)的残基在去除NPE基团的条件下是否会变化。例如，在一些实施例中，除了式X
‑
1中显示的NPE基团之外，没有其他保护基团被脱保护，则式X
‑
1和X
‑
2中的R
10
可以是相同的。在一些实施例中，式X
‑
2中的R
10
可以表示式X
‑
1中R
10
的脱保护版本。
[0023]寡核苷酸(以及起始寡核苷酸)没有特别限制。在一些实施例中，寡核苷酸是磷酰二胺吗啉代寡聚物。典型地，寡核苷酸包含用于序列特异性结合靶核酸的靶向碱基序列。当杂交以反平行构型发生时，将靶序列和靶向序列描述为彼此“互补”。靶向序列可以与靶序列具有“接近”或“实质”的互补性，并且对于当前所描述的方法的目的仍然起作用，即仍然是“互补的”。优选地，在当前描述的方法中采用的寡核苷酸类似物化合物与靶序列具有最多一个错配/10个核苷酸，并且优选地20个核苷酸中最多一个错配。可替代地，采用的反义寡聚物与如本文指定的示例性靶向序列具有至少80％、至少90％的序列同源性或至少95％的序列同源性。出于与RNA靶标互补结合的目的并且如下所讨论，鸟嘌呤碱基可以与胞嘧啶或尿嘧啶RNA碱基互补。
[0024]多种胺保护基团可以用作R
11
。典型地，R
11
是可以通过用NH3处理去除的胺保护基团。例如，在一些实施例中，R
11
是酰基基团，即R
B
‑
C(＝O)
‑
，其中R
B
可以是例如氢、烷基、芳基、环烷基、杂芳基，其中每一个是任选取代的。在一些实施例中，R
11
是
‑
C(＝O)
‑
R
B
，其中R
B
是任选取代的C1‑6烷基，例如，C1‑6烷基(例如，异丙基)、芳基取代的C1‑6烷基(例如，苄基)或芳基氧基取代的C1‑6烷基。在一些特别的实施例中，R
11
可以是
‑
C(＝O)
‑
R
B
，其中R
B
是C1‑6烷基(例如，异丙基)、芳基(例如，苯基)、或芳基取代的C1‑6烷基(例如，苄基)，优选地，R
B
是异丙
基。
[0025]在一些优选实施例中，具有式X
‑
1的化合物不与固体支持物结合。不希望受理论的束缚，认为在不与固体支持物结合的情况下，可以控制式X
‑
1的NPE基团的脱保护，使得4
‑
硝基苯乙烯副产物可以优先于具有式X
‑
2的化合物与反应介质中的清除剂反应。然而，在一些实施例中，具有式X
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备寡核苷酸的方法，该方法包括：(a)将具有式X
‑
1的化合物转化为具有式X
‑
2的化合物：其中：R
10
是起始寡核苷酸(例如，磷酰二胺吗啉代寡聚物)的残基；R
11
是胺保护基团；其中该具有式X
‑
1的化合物不与固体支持物结合；以及(b)任选地去除该具有式X
‑
2的化合物中的保护基团以获得该寡核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其中该转化包括将(优选在溶液中的)该具有式X
‑
1的化合物添加到包含碱性试剂和能够与具有下式X
‑
3的化合物反应的清除剂的混合物中：3.如权利要求2所述的方法，其中该碱性试剂是碱性有机胺，该碱性有机胺在水中的pKa为约9或更高；例如，该碱性试剂是碱性环胺，如1,8
‑
二氮杂双环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯或1,5
‑
二氮杂双环[4.3.0]壬
‑5‑
烯。4.如权利要求2
‑
5中任一项所述的方法，其中该清除剂具有
‑
SH或1,3
‑
二羰基部分；例如，该清除剂是具有X
‑
4的化合物：其中：q是0、1或2；并且R
A
每次出现时独立地是任选取代的C1‑6烷基(例如，甲基)。5.如权利要求2
‑
4中任一项所述的方法，其中该清除剂是胸腺嘧啶或其衍生物。6.如权利要求2
‑
5中任一项所述的方法，其中R
11
是可以通过用NH3处理去除的胺保护基团，例如，R
11
是酰基基团，如
‑
C(＝O)
‑
R
B
，其中R
B
是任选取代的C1‑6烷基，例如C1‑6烷基(例如异丙基)、芳基取代的C1‑6烷基(例如苄基)或芳基氧基取代的C1‑6烷基。7.一种用于制备寡核苷酸的方法，该方法包括：(a)将具有式X
‑
5的化合物转化为具有式X
‑
6的化合物：
其中：m1和m2独立地为0
‑
50(例如，0
‑
30)的整数；R
11
是胺保护基团；碱基每次出现时独立地是选自G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、A(腺嘌呤)、U(尿嘧啶)、和T(胸腺嘧啶)、其修饰的类似物及其受保护的衍生物的碱基，条件是当式X
‑
5中的碱基是受保护的碱基时，式X
‑
6中的相应碱基可以是相同的受保护的碱基或相应的部分或完全脱保护的碱基；其中：T1是合适的5
’
末端基团(例如，短肽、任选取代的烷基氨基基团、任选取代的杂环基等)；并且T2是合适的3
’
末端基团，例如氢或保护基团(例如，酰基基团、三苯甲基等)；以及(b)任选地部分或完全去除该具有式X
‑
6的化合物中的保护基团以获得该寡核苷酸。8.如权利要求7所述的方法，其中式X
‑
5或X
‑
6中的碱基每次出现时独立地选自
其中R
11
是胺保护基团。9.如权利要求7或8所述的方法，其中m1和m2中的一个是0，或者m1或m2都不是0。10.如权利要求7或8所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡辰辰，赵强，李青，杨纪民，
申请(专利权)人：上海合全药物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：