一种构建高效生物合成维生素K2工程菌的方法技术

本发明专利技术涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种构建高效生物合成维生素K2工程菌的方法，包括如下步骤：步骤一、构建得到

【技术实现步骤摘要】
一种构建高效生物合成维生素K2工程菌的方法


[0001]本专利技术涉及遗传工程
，尤其涉及一种构建高效生物合成维生素K2工程菌的方法。

技术介绍

[0002]维生素K2是一类脂溶性维生素，为甲萘醌类系列化合物，其结构由2
‑
甲基
‑
1,4
‑
萘醌母核和不同长度的异戊二烯侧链构成。根据其分子结构上C
‑
3位异戊二烯侧链数量的不同可分为不同的异构体。其中，含有七个异戊二烯侧链的甲萘醌
‑
7(MK
‑
7)是维生素K2活力最高的结构形式。
[0003]目前维生素K2主要以化学合成为主，但传统化学合成法存在化学原料来源限制、化学反应产生大量异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且合成的维生素K2中异戊二烯侧链多为顺式结构，活性低。因此，工业上采用微生物发酵生产维生素K2备受青睐。它的最大优点是：能够大大简化生产工序并改善劳动条件、减少环境污染、同时也有利于资源开发和综合利用。然而现有菌株发酵生产维生素K2的产量相对较低，发酵水本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建高效生物合成维生素K2工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，敲除嘌呤转运蛋白基因pbuE，构建得到
△
pbuE菌株EC1；步骤二、以菌株EC1全基因组为模板，用P
degQ
启动子序列替换枯草芽孢杆菌法呢基二磷酸合酶基因ispA的原始启动子，得到菌株EC2；步骤三、以菌株EC2全基因组为模板，敲除1
‑
脱氧木酮糖
‑5‑
磷酸合酶基因dxs，得到菌株EC3；步骤四、以克雷伯氏菌全基因组为模板，扩增得到dxs基因，通过与pHY
‑
P
43
载体连接转化至菌株EC3中，得到用于生物合成维生素K2菌株的EC4。2.根据权利要求1所述构建高效生物合成维生素K2工程菌的方法，其特征在于，所述步骤一中构建得到
△
pbuE菌株EC1的方法包括如下步骤：A1、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用如SEQ ID NO.1
‑
3所示的引物组扩增得到左同源臂、右同源臂序列和中间片段；A2、将获得的左同源臂、右同源臂序列和中间片段进行重叠延伸PCR，得到融合基因片段；A3、扩增产物纯化后，融合基因片段电转到菌株枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，即得菌株EC1。3.根据权利要求1所述构建高效生物合成维生素K2工程菌的方法，其特征在于，所述步骤二中得到菌株EC2的方法包括如下步骤：B1、以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，利用如SEQ ID NO.7
‑
8所示的引物扩增得到ispA1原始启动子的左同源臂、P
degQ
序列和右同源臂序列；B2、以质粒p7C6为模板，利用如SEQ ID NO.25
‑
26所示的引物扩增得到氯霉素抗性基因Cm
R
序列；B3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳，胡刘秀，周梦洁，胡汶松，黄俊宝，黄茜琳，罗雅妮，高旭丽，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：