本发明专利技术公开了一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用，步骤包括：构建sgRNA表达质粒、打靶Donor载体，将sgRNA质粒、Cas9质粒和打靶Doner载体共同电转H9人胚胎干细胞系，镜下观察并挑选并验证，得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系。本发明专利技术优点包括：结合CreERT2/Loxp技术可以在该细胞系上对特定的细胞群进行标记，并在人胚胎干细胞3D培养分化过程中实现对单细胞的谱系追踪，用于在类器官水平研究胚胎干细胞到成体细胞分化和发育过程。胞分化和发育过程。胞分化和发育过程。
【技术实现步骤摘要】
一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用
[0001]本专利技术属于发育生物学领域，具体涉及一种Brainbow敲入的人胚胎干细系技术。
技术介绍
[0002]人胚胎干细胞(Human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。将hESCs培养在支持介质(如基质胶)上，通过在特定培养基中添加不同的细胞因子，使hESCs能够在体外扩增和分化为多种细胞类型，用于体外3D培养建立机体多种系统的类器官模型。
[0003]人类第19号染色体上的AAVS1位点(又名为PPP1R2C位点)是一个开放的染色体结构，能保证转入的基因能被正常转录。经过验证，该位点中转入的DNA片段能发挥其预期功能，且在该位点插入外源基因片段对细胞无伤害。靶向AAVS1位点的CRISPR
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Cas9系统能特异性剪切AAVS1位点，生成DNA双链断裂，诱导DNA同源重组修复，将供体克隆上的DNA片段整合到基因组的AAVS1位点上。
[0004]Brainbow中编码荧光蛋白的基因与单个启动子串联在一起，紧挨着启动子的基因能够正常表达。Brainbow 2.1版本使用绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和青色荧光蛋白(CFP)，GFP紧挨着启动子，因此细胞在默认情况下发出绿色荧光。若通过Cre介导的重组允许下游编码其他荧光蛋白的基因表达，能使子代细胞随机表达GFP、RFP、YFP和CFP。这种技术可以通过构建含多色荧光蛋白(XFP)的重组载体，利用它来标记器官或生物体，载体上的随机重组使细胞呈现出独特的颜色，并且子代细胞都保留这种颜色，可用于标记特定的细胞群并实现对单细胞进行谱系追踪，实现在类器官水平上研究胚胎干细胞到成体细胞分化和发育过程的目的。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用，该细胞系可应用于标记特定的细胞群并实现对单细胞进行谱系追踪，在类器官水平上研究胚胎干细胞到成体细胞分化和发育的过程。
[0006]本专利技术解决技术问题的方案如下：
[0007]本专利技术提供一种靶向AAVS1位点的sgRNA，sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术提供一种含有如权利要求1所述的靶向AAVS1位点的sgRNA的sgRNA质粒。
[0009]本专利技术提供一对与AAVS1切割位点上下游序列相同的同源臂，包括与AAVS1切割位点上游序列相同的AAVS1同源臂1，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示，以及包括与AAVS1切割位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，其序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]本专利技术提供一种含有所述一对与AAVS1切割位点上下游序列相同的同源臂的质粒。
[0011]本专利技术提供一种打靶Donor载体，其具有：
[0012]与AAVS1切割位点上游序列相同的AAVS1同源臂1、与AAVS1切割位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，以及位于AAVS1同源臂1和AAVS1同源臂2之间的待重组入AAVS1位点的编码多色荧光蛋白的基因。
[0013]AAVS1同源臂1的序列如SEQ ID NO.2所示，AAVS1同源臂2的序列如SEQ ID NO.3所示；打靶Donor载体的特异性DNA序列包含AAVS1同源臂1、编码多色荧光蛋白的基因、AAVS1同源臂2。
[0014]更优地，所述编码多色荧光蛋白是编码GFP、RFP、YFP和CFP的基因，该基因片段由CMV
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Brainbow
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2.1R质粒中克隆得到，所述特异性DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]本专利技术提供一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系，人胚胎干细胞系的AAVS1位点敲入了编码多色荧光蛋白的基因。
[0016]进一步地，所述编码多色荧光蛋白是编码GFP、RFP、YFP和CFP的基因，所述细胞系的特异性DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0017]本专利技术还提供一种所述AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0018](1)针对AAVS1位点设计合成相应的sgRNA，并构建sgRNA质粒；
[0019](2)设计与AAVS1位点上游序列相同的AAVS1同源臂1、与AAVS1位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，构建带同源臂的质粒；
[0020](3)将编码多色荧光蛋白的基因连至带同源臂的质粒构成打靶Donor载体；
[0021](4)将sgRNA质粒、Cas9质粒和打靶Donor载体共同电转H9人胚胎干细胞系，培养得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系。
[0022]更优地，上述构建方法详细过程如下：
[0023](1)针对AAVS1位点设计并合成相应的sgRNA，室温退火后连入经BsmBI单酶切的pU6
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EFsgRNA2.0scaffold载体，筛选后获得最高切割活性的sgRNA质粒，其sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
[0024](2)设计与AAVS1位点上游序列相同的AAVS1同源臂1、与AAVS1位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，AAVS1同源臂1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，AAVS1同源臂2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，将AAVS1同源臂1和AAVS1同源臂2克隆至Donor载体中，得到带有同源臂的Donor质粒；
[0025](3)将编码多色荧光蛋白的基因连至带有同源臂的Donor质粒中，构成靶向AAVS1位点的打靶Donor载体，命名为pAAVS1:Brainbow；
[0026](4)将sgRNA质粒，Cas9质粒和打靶Donor载体按数量比例为1:4:10共同电转H9人胚胎干细胞系，电转条件为300mA，4ms，培养48小时后加入1μg/ml的嘌呤霉素培养24小时，通过有限稀释法将80个单克隆细胞铺于96孔板中，继续培养半个月后，将挑取的单克隆细胞转至24孔板进行培养，镜下观察并挑选出表达入核GFP荧光蛋白的重组单克隆细胞，得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系，命名为H9
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AAVS1
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Brainbow#3。
[0027]优选地，编码多色荧光蛋白的基因为编码GFP、RFP、YFP和CFP的基因，打靶Donor载体特异性的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0028]本专利技术还提供一种所述AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系在人胚胎干细胞3D培养分化过程中对单细胞的谱系追踪以及在类器官水平研究胚胎干细胞到成体细胞分
化和发育过程的应用。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种靶向AAVS1位点的sgRNA，其特征在于，sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种含有如权利要求1所述的靶向AAVS1位点的sgRNA的sgRNA质粒。3.一对与AAVS1切割位点上下游序列相同的同源臂，其特征在于，包括与AAVS1切割位点上游序列相同的AAVS1同源臂1，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示，以及包括与AAVS1切割位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，其序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种含有如权利要求4所述一对与AAVS1切割位点上下游序列相同的同源臂的质粒。5.一种打靶Donor载体，其特征在于，其具有：与AAVS1切割位点上游序列相同的AAVS1同源臂1、与AAVS1切割位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，以及位于AAVS1同源臂1和AAVS1同源臂2之间的待重组入AAVS1位点的编码多色荧光蛋白的基因，AAVS1同源臂1的序列如SEQ ID NO.2所示，AAVS1同源臂2的序列如SEQ ID NO.3所示；打靶Donor载体的特异性DNA序列包含AAVS1同源臂1、编码多色荧光蛋白的基因、AAVS1同源臂2。6.一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系，其特征在于，人胚胎干细胞系的AAVS1位点敲入了编码多色荧光蛋白的基因。7.一种如权利要求6所述AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)针对AAVS1位点设计合成相应的sgRNA，并构建sgRNA质粒；(2)设计与AAVS1位点上游序列相同的AAVS1同源臂1、与AAVS1位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，构建带同源臂的质粒；(3)将编码多色荧光蛋白的基因连至带同源臂的质粒构成打靶Donor载体；(4)将sgRNA质粒、Cas9质粒和打靶Donor载体共同电转H9人胚胎干细胞系，培养得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系。8.根据权利要求7所述一种AAVS1:Brai...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，郑雯，钟亚丹，杨斌，
申请(专利权)人：南方医科大学皮肤病医院广东省皮肤病医院，广东省皮肤性病防治中心，中国麻风防治研究中心，
类型：发明
国别省市：
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