一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用，步骤包括：构建sgRNA表达质粒、打靶Donor载体，将sgRNA质粒、Cas9质粒和打靶Doner载体共同电转H9人胚胎干细胞系，镜下观察并挑选并验证，得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系。本发明专利技术优点包括：结合CreERT2/Loxp技术可以在该细胞系上对特定的细胞群进行标记，并在人胚胎干细胞3D培养分化过程中实现对单细胞的谱系追踪，用于在类器官水平研究胚胎干细胞到成体细胞分化和发育过程。胞分化和发育过程。胞分化和发育过程。

【技术实现步骤摘要】
一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于发育生物学领域，具体涉及一种Brainbow敲入的人胚胎干细系技术。

技术介绍

[0002]人胚胎干细胞(Human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。将hESCs培养在支持介质(如基质胶)上，通过在特定培养基中添加不同的细胞因子，使hESCs能够在体外扩增和分化为多种细胞类型，用于体外3D培养建立机体多种系统的类器官模型。
[0003]人类第19号染色体上的AAVS1位点(又名为PPP1R2C位点)是一个开放的染色体结构，能保证转入的基因能被正常转录。经过验证，该位点中转入的DNA片段能发挥其预期功能，且在该位点插入外源基因片段对细胞无伤害。靶向AAVS1位点的CRISPR
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Cas9系统能特异性剪切AAVS1位点，生成DNA双链断裂，诱导DNA同源重组修复，将供体克隆上的DNA片段整合到基因组的AAVS1位点上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向AAVS1位点的sgRNA，其特征在于，sgRNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种含有如权利要求1所述的靶向AAVS1位点的sgRNA的sgRNA质粒。3.一对与AAVS1切割位点上下游序列相同的同源臂，其特征在于，包括与AAVS1切割位点上游序列相同的AAVS1同源臂1，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示，以及包括与AAVS1切割位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，其序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种含有如权利要求4所述一对与AAVS1切割位点上下游序列相同的同源臂的质粒。5.一种打靶Donor载体，其特征在于，其具有：与AAVS1切割位点上游序列相同的AAVS1同源臂1、与AAVS1切割位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，以及位于AAVS1同源臂1和AAVS1同源臂2之间的待重组入AAVS1位点的编码多色荧光蛋白的基因，AAVS1同源臂1的序列如SEQ ID NO.2所示，AAVS1同源臂2的序列如SEQ ID NO.3所示；打靶Donor载体的特异性DNA序列包含AAVS1同源臂1、编码多色荧光蛋白的基因、AAVS1同源臂2。6.一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系，其特征在于，人胚胎干细胞系的AAVS1位点敲入了编码多色荧光蛋白的基因。7.一种如权利要求6所述AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)针对AAVS1位点设计合成相应的sgRNA，并构建sgRNA质粒；(2)设计与AAVS1位点上游序列相同的AAVS1同源臂1、与AAVS1位点下游序列相同的AAVS1同源臂2，构建带同源臂的质粒；(3)将编码多色荧光蛋白的基因连至带同源臂的质粒构成打靶Donor载体；(4)将sgRNA质粒、Cas9质粒和打靶Donor载体共同电转H9人胚胎干细胞系，培养得到AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系。8.根据权利要求7所述一种AAVS1:Brai...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，郑雯，钟亚丹，杨斌，
申请(专利权)人：南方医科大学皮肤病医院广东省皮肤病医院，广东省皮肤性病防治中心，中国麻风防治研究中心，
类型：发明
国别省市：