一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法技术方案

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法，属于生物技术领域，该方法主要包括：(1)根据生物信息学找出位于Y染色体上的特异靶向重复序列并设计相应的gRNA；(2)进行CRISPR/Cas9载体的制备；(3)将构建好的载体电转入公猪胎儿成纤维细胞中，并通过q

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法。

技术介绍

[0002]染色体作为生物遗传物质的载体，对当前生命遗传研究开展尤为重要。染色体消除技术(Chromosome elimination technology)作为近年来基因编辑技术不断成熟发展的产物，在动物模型构建、家畜育种改良中的性别控制、特定染色体的功能研究以及人类非整倍体疾病治疗等领域具有重要的应用价值。目前通过该技术已成功在人、小鼠、斑马鱼等物种上实现了特定染色体的消除，然而打靶效率低、非靶点的额外失活及操作过程的繁琐性大大制约了该技术的发展。但随着新一代CRISPR/Cas9技术的出现，灵活的靶点选择、较高的编辑效率以及对于靶点多重切割的可能性使该技术的普及成为了可能。
[0003]目前，研究者们已通过锌指核酸酶(ZFN)技术、Cre/loxP系统、TKNEO基因敲入等多种方法实现了目标染色体的敲除，但这些方法具有较高门槛，极大限制该技术在生产科研中的运用。如ZFN中由于锌指蛋白识别序列较长，存在潜在毒性；Cre/loxP系统引入特定表达元件及其本身对细胞产生的潜在毒性使其真正发挥作用较为困难；TKNEO目标染色体敲入后进行药筛两步操作的繁琐性，这些都会影响靶基因的切割效率，极大制约该技术的发展。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法。通过CRISPR/Cas9技术，在猪的特定染色体寻找能够被特异sgRNA识别的重复序列，进行多位点切割以实现目标染色体的降解。为特定染色体及其携带基因功能的研究提供了一种新的工具，同时也为实现大型家畜性别控制提供一种新的技术方案。
[0005]本专利技术采用的具体方案为：本专利技术的第一方面，是提供基于CRISPR/Cas9系统用于敲除猪细胞Y染色体的sgRNA，所述的sgRNA靶点序列为AAGAAGCGCTCTAGAACAGG(如SEQ ID NO：01所示)，sgRNA序列为CACCGAAGAAGCGCTCTAGAACAGG(如SEQ ID NO：02所示)。
[0006]优选地，所述猪细胞为猪胎儿成纤维细胞。
[0007]本专利技术的第二方面，是提供上述sgRNA在猪细胞Y染色体消除方面的应用。
[0008]本专利技术的第三方面，是提供一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法，包括以下步骤：步骤一、根据生物信息学找出位于Y染色体上的特异靶向重复序列并进行sgRNA设计，所述的sgRNA靶点序列为AAGAAGCGCTCTAGAACAGG，sgRNA序列为CACCGAAGAAGCGCTCTAGAACAGG。步骤二、制备CRISPR/Cas9载体：合成的sgRNA经过退火形成双链与线性化的
px330_Cas9_GFP质粒进行连接、转化，挑取单克隆；步骤三、将经步骤二构建好的载体电转入公猪胎儿成纤维细胞中，经验证后获取阳性目标单克隆。
[0009]优选地，步骤二所述CRISPR/Cas9载体制备时采用载体HP180_px330_GFP。
[0010]有益效果：本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas9的猪染色体消除技术，通过寻找能够被特异sgRNA识别的重复序列，进行多位点切割以实现目标染色体的降解。打靶效率高且脱靶率低，为特定染色体及其携带基因功能的研究提供了一种新的工具，同时也为实现大型家畜性别控制提供一种新的技术方案。
附图说明
[0011]图1为目标靶基因与整个染色体组比对结果示意图；图2为HP180_px330_GFP载体结构图；图3为pU6
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Cas9
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gRNA
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GFP质粒测序结果图；图4为靶基因定量结果图；图5为流式分选结果图；图6为PCR鉴定单克隆结果图；图7为核型分析结果图；图8是本申请所述方法的技术流程图。
具体实施方式
[0012]一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据生物信息学找出位于Y染色体上的特异靶向重复序列，并根据这些序列设计相应的gRNA；(2)进行CRISPR/Cas9载体的制备，合成的sgRNA经过退火形成双链与线性化的px330_Cas9_GFP质粒进行连接、转化，挑取单克隆；(3)将构建好的载体电转入公猪胎儿成纤维细胞中，并通过q
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PCR验证其在细胞水平的靶基因表达水平下降情况；(4)最终选择效率较高的gRNA电转，进行流式分选稀释获取单克隆，并对单克隆进行PCR及核型分析验证。
[0013]步骤1)中，Y染色体上所有基因需在ensembl上下载并用awk命令提取。
[0014]步骤1)中，特异靶向重复序列获得需要Y上每个基因与全基因组序列进行比对得出。
[0015]步骤1)中，gRNA的靶基因需要在各个数据库中稳定存在且拷贝数目多。
[0016]步骤1)中，gRNA的靶基因需要是散在重复或簇状聚集序列。
[0017]步骤2)中，所述CRISPR/Cas9载体为HP180_px330_GFP，便于后期流式分选。
[0018]步骤3)中，定量检测时以相同浓度的DNA为模板(靶基因非编码蛋白)检测其相对含量是否降低
[0019]步骤4)中，核型分析对象为PCR鉴定为阳性的单克隆细胞团。
[0020]本专利技术的主要目的是提供一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法，该方法包括利用生物信息学寻找Y染色体的特异重复序列，并设计相应的sgRNA进行验证选出合适靶点并最终挑选出目标单克隆。该过程科学先进，通过本专利技术，克服现有技术缺点，在猪染色体敲除方面奠定了广泛应用基础。
[0021]首先，根据生物信息学找出位于Y染色体上的特异靶向重复序列，并根据这些序列设计相应的gRNA。对设计好的gRNA进行体外Cas9切割验证，选择体外切割效率较高的gRNA进行细胞水平的敲除。之后进行CRISPR/Cas9载体的制备，将构建好的载体电转入公猪胎儿成纤维细胞中，并通过q
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PCR验证其在细胞水平的靶基因表达水平下降情况。最终选择效率较高的gRNA电转，进行流式分选稀释获取单克隆，并对单克隆进行PCR及核型分析验证。
[0022]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0023]本实施例中使用的引物均使用Primer6软件设计，由北京六合华大基因科技有限公司合成，载体HP180_px330_GFP由国家生猪种业工程技术研究中心提供。其它若无说明，所用试剂均为常规试剂，所用方法均为常规方法。
[0024]1、在ensembl获取整个Y染色体注释文件，在Linux下用awk命令提注释文件中的所有基因，并在ensembl上将每个基因与全基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR/Cas9系统用于敲除猪细胞Y染色体的sgRNA，其特征在于：所述的sgRNA靶点序列为AAGAAGCGCTCTAGAACAGG，sgRNA序列为CACCGAAGAAGCGCTCTAGAACAGG。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统用于敲除猪细胞Y染色体的sgRNA，其特征在于：所述猪细胞为猪胎儿成纤维细胞。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9系统用于敲除猪细胞Y染色体的sgRNA在猪细胞Y染色体消除方面的应用。4.一种基于CRISPR/Cas9系统敲除猪细胞Y染色体的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、根据生物信息学找出位于Y染色体上的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珍芳，孟繁明，杨化强，霍梦飞，郑恩琴，杨杰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：