本发明专利技术公开了一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括植物体的选择及无菌处理、愈伤组织诱导培养和大规模培养三个环节，所述的诱导培养基为：ＭＳ培养基＋蔗糖２０～３０ｇ／Ｌ＋琼脂４～６ｇ／Ｌ＋α－萘乙酸２．０～３．０ｍｇ／Ｌ＋６－苄氨基嘌呤２．０～３．０ｍｇ／Ｌ；所述的大规模培养基为：ＭＳ培养基＋蔗糖２０～５０ｇ／Ｌ＋α－萘乙酸０．１～５．０ｍｇ／Ｌ＋６－苄氨基嘌呤０．１～５．０ｍｇ／Ｌ。该方法易操作，有效成分含量高，生产成本低，不污染环境，可达到产业化水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养
，具体是一种。
技术介绍
铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall, ex Lindl.)为兰禾斗(Orchidaceae)石斛 属(Dendrobium)多年生附生草本植物，因老茎茎节处呈褐色，又名黑节草，是一种集观赏 和药用于一身的名贵珍稀草本植物，具有独特的药用价值，为石斛之极品。石斛是我国古文 献中最早记载的兰科植物之一，其性味甘淡、微咸，性属清润，清中有补，补中有清。早在东 汉时期的《神农本草经》中已记载石斛"主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚 肠胃"。成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为"中华九大仙草"之首， 为历代帝王梦寐以求的宝物，素有"千金草"之称，驰名中外，被国际药用植物界称为"药界 大熊猫"，民间称其为"救命仙草"。现代药理学研究表明，石斛多糖具有增强T细胞及巨噬 细胞免疫活性的作用，是一种前景可喜的中药免疫增强剂，并具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、 抗诱变等作用，受到国内外学者的高度重视。 铁皮石斛常附生于树木或岩石上，植株比较矮小，生长发育缓慢，叶片面积小、光 合面积小、强度低，尤其是种子极小，胚具后熟现象，因此自然条件下种子难以萌发(萌发 率低于5% )。在通常的栽培条件下，铁皮石斛由种子到开花需要3 4年，常需与某些真 菌共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生 长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生铁皮石斛资源的掠夺式采挖，其生境被严重破 坏，致使野生铁皮石斛濒临灭绝。 国内外学者开展了对野生铁皮石斛全面的研究，包括化学成分，药理活性，人工 种植等方面的研究。而铁皮石斛的培养主要集中在愈伤组织诱导、基本培养条件筛选和 理化因子的考查等方面。铁皮石斛试管苗的繁殖一般要经过类原球茎(protocorm-like bodies,即PLBs)阶段，而类原球茎实质上是正在生长分化的体细胞胚胎，具有与原植株相 同的物质代谢和形态发育潜能。鉴于此，人们提出用类原球茎代替原植株成为新药源的可 能性。然而，已有的研究结果表明，从铁皮石斛不同部位诱导出类原球茎的研究还存在诱导 率低、分化快和褐变等问题尚没有解决，目前还没有找到一个切实有效地培养技术用以解 决铁皮石斛类原球茎诱导和增殖以及代谢产物控制中存在的疑点和难点，从而影响了铁皮 石斛的深入研究和开发。 天然铁皮石斛已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁 采摘。为此研究铁皮石斛类原球茎的培养，实现产业化显得十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种繁殖速度快，石斛多糖含量 高的。 本专利技术的目的是这样实现的一种，它包括如 下步骤 a、植物体的选择及无菌处理 选择6 8月份生长的铁皮石斛野生新鲜植株，除去根和叶进行清洗和无菌处理， 选取实生苗的幼茎，将幼茎剪成0. 3 0. 5cm2大小铁皮石斛组织； b、组织诱导培养 将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周 期10 24天，培养温度10 30。C，光照时间l 24小时/天，光照强度0 100iimo1/ m2*s ;所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖0 50g/L+琼脂0 10g/L+a-萘乙酸0. l 5. Omg/L+6-节氨基嘌呤0. 1 5. Omg/L， pH值为5. 0 7. 0 ; c、大规模培养 将诱导出的铁皮石斛类原球茎在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期 10 24天，培养温度10 30。C，光照时间0 24小时/天，光照强度0 100iimo1/ m2 s ;所述的大规模培养基为MS培养基+蔗糖20 50g/L+a-萘乙酸0. 1 5. Omg/ L+6-节氨基嘌呤0. 1 5. Omg/L， pH值为5. 0 7. 0。 作为本专利技术更优化的技术方案，对培养基的配 方比例和培养条件进行优化选择。所述的丛生芽诱导培养培养周期15 20天，培养温度20 25。C，光照时间8 20小时/天，光照强度50 80 ii mol/m2 s ;所述的诱导培养基为MS培养基+蔗糖 20 30g/L+琼脂4 6g/L+ a-萘乙酸2.0 3. Omg/L+6-节氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L， pH值为5. 5 6. 5 ;所述的大规模培养培养周期15 20天，培养温度20 25"，光照 时间8 20小时/天，光照强度50 80 ii mol/m2 s ;所述的大规模培养基为MS培养 基+蔗糖30 40g/L+ a -萘乙酸2. 0 3. Omg/L+6-节氨基嘌呤2. 0 3. Omg/L， pH值为 5. 5 6. 5。植物体的的无菌处理是本专利技术的重要技术环节，无菌处理的方法包括如下步骤 a)将选取的铁皮石斛健康实生苗的幼茎，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，置 超净工作台内； b)将铁皮石斛幼茎用70 80%的酒精浸泡20 40秒进行表面灭菌，再用无菌 水清洗干净； c)将经过酒精灭菌的铁皮石斛幼茎用0. 05 0. 15%氯化汞溶液浸泡消毒3 6 分钟，用无菌水冲洗4 5次，再用滤纸吸干无菌水； d)无菌条件下将氯化汞消毒的铁皮石斛幼茎剪成0. 3 0. 5cm2大小铁皮石斛组 织，接种于诱导培养基中，每瓶接种5块。 本专利技术的优点在于该方法容易操作，生产成本低，不污染环境，可以实现批量生 产。选用配方合理的诱导培养基，愈伤组织的诱导率平均为99. 6% ，通过两段培养的方式铁 皮石斛类原球茎产量大幅度提高，和野生铁皮石斛比较石斛多糖含量提高1倍以上。通过 本专利技术方法生产铁皮石斛类原球茎，不变性，产量大，成本低，周期短，极具市场竞争力。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1 :一种，它包括如下步骤 a、植物体的选择及无菌处理 a)选择7月份生长的铁皮石斛野生健康实生苗的幼茎，用自来水冲洗干净，再用 蒸馏水冲洗，置超净工作台内；b)将铁皮石斛幼茎用75%的酒精浸泡30秒进行表面灭菌， 再用无菌水清洗干净；c)将经过酒精灭菌的铁皮石斛幼茎用0. 1%氯化汞溶液浸泡消毒5 分钟，用无菌水冲洗5次，再用滤纸吸干无菌水；d)无菌条件下将氯化汞消毒的铁皮石斛幼 茎剪成0. 3 0. 5cm2大小铁皮石斛组织，接种于诱导培养基中，每瓶接种5块。 b、组织诱导培养 将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周 期16天，培养温度2(TC，光照时间10小时/天，光照强度80 P mol/m2 s ;所述的诱导 培养基为MS培养基+蔗糖28g/L+琼脂4. 5g/L+ a -萘乙酸2mg/L+6_苄氨基嘌呤3mg/L， pH值为5. 5 ; c、大规模培养 将诱导出的铁皮石斛类原球茎在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期18 天，培养温度22t:，光照时间10小时/天，光照强度80ymol/m2 s ;所述的大规模培养 基为MS培养基+蔗糖40g/L+ a -萘乙酸2mg/L+6-苄氨基嘌呤3mg/L， pH值为5. 5。 实施例2 :—种，它包括如下步骤 a、植物体的选择及无菌处理 a)选择7月本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组织培养铁皮石斛类原球茎的方法，它包括如下步骤：ａ、植物体的选择及无菌处理：选择６～８月份生长的铁皮石斛野生新鲜植株，除去根和叶进行清洗和无菌处理，选取实生苗的幼茎，将幼茎剪成０．３～０．５ｃｍ↑［２］大小铁皮石斛组织；ｂ、组织诱导培养：将经过无菌处理后的铁皮石斛组织在诱导培养基中进行组织诱导培养，培养周期：１０～２４天，培养温度：１０～３０℃，光照时间：１～２４小时／天，光照强度：０～１００μｍｏｌ／ｍ↑［２］.ｓ；所述的诱导培养基为：ＭＳ培养基＋蔗糖０～５０ｇ／Ｌ＋琼脂０～１０ｇ／Ｌ＋α－萘乙酸０．１～５．０ｍｇ／Ｌ＋６－苄氨基嘌呤０．１～５．０ｍｇ／Ｌ，ｐＨ值为５．０～７．０；ｃ、大规模培养：将诱导出的铁皮石斛类原球茎在培养基中进行大规模培养，培养周期：１０～２４天，培养温度：１０～３０℃，光照时间：０～２４小时／天，光照强度：０～１００μｍｏｌ／ｍ↑［２］.ｓ；所述的大规模培养基为：ＭＳ培养基＋蔗糖２０～５０ｇ／Ｌ＋α－萘乙酸０．１～５．０ｍｇ／Ｌ＋６－苄氨基嘌呤０．１～５．０ｍｇ／Ｌ，ｐＨ值为５．０～７．０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾景明，
申请(专利权)人：烟台汇鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]
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