基于碱性磷酸酶的单分子RNA显色原位检测方法和试剂盒技术

一种基于碱性磷酸酶的单分子RNA显色原位检测的方法，光学显微镜下实现RNA原位检测的方法，以固定的细胞或组织为待测样品，将设计的锁式探针导入含目标RNA的细胞中，使锁式探针与靶序列杂交，通过DNA连接酶将锁式探针的5

【技术实现步骤摘要】
基于碱性磷酸酶的单分子RNA显色原位检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于RNA检测
，具体涉及一种基于碱性磷酸酶的光学显微镜下实现RNA原位检测的方法。

技术介绍

[0002]由于成像技术和分子工程的迅速发展，如今RNA可以在单分子水平上进行原位可视化，达到细胞和亚细胞分辨率。这种高分辨率的单分子分析为更好地了解被检测基因的生理和病理功能提供了帮助。目前，实现原位单分子RNA检测的方法大多都是基于荧光信号的原位成像技术，例如：单分子荧光原位杂交(SmFISH)、基于滚环扩增的方法和基于杂交链式反应(HCR)的方法等。这些基于荧光检测的技术都依赖于修饰了荧光染料的检测探针，然而，荧光检测容易受到光漂白等影响，且严重依赖于昂贵的荧光显微镜。通过酶促显色分析进行RNA单分子定位是一种简单方便的原位检测方法，可以直接在光学显微镜下观察到细胞或组织中目标RNA的空间信息。已经报导的单分子显色原位杂交法有通过连接辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)的检测探针(Detection Probe，DP)催化二氨基联苯胺(3,3
’‑
Diaminobenzidine，DAB)产生棕褐色沉淀。

技术实现思路

[0003]本专利技术的一个目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可产生红色沉淀，更容易在光学显微镜下观察，特别适应于黑色素瘤等黑色素沉着组织，该方法跟HRP(辣根过氧化物酶)催化的DAB(二氨基联苯胺)方法结合，可以实现单分子RNA的双重检测。
[0004]本专利技术的另一个目的在于提供一种RNA原位检测的方法，用于实施固定的细胞或组织中RNA单分子显色原位杂交分析，提高检测的可辨识性，在光学显微镜即可实现。
[0005]本专利技术提供一种RNA原位检测的方法，采用检测探针(Detection Probe，DP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)通过生物素和链霉亲和素结合后而被固定于滚环扩增产物(Rolling Circle Product，RCP)上，再使ALP(碱性磷酸酶)作用于FAST RED(固红)/Naphthol(萘酚)显色底物，产生光学显微镜下可见的红色沉淀。与HRP(辣根过氧化物酶)催化DAB(二氨基联苯胺)酶促反应相比，可产生红色沉淀，更容易在光学显微镜下观察，特别适应于黑色素瘤等黑色素沉着组织，该方法跟HRP(辣根过氧化物酶)催化的DAB(二氨基联苯胺)方法结合，可以实现单分子RNA的双重检测。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种基于碱性磷酸酶的光学显微镜下实现RNA原位检测的方法，包括将设计的锁式探针(Padlock Ligation Probe，PLP)导入包含拟检测目标RNA的细胞中，与靶序列杂交并通过DNA连接酶形成环状单链DNA分子，再以滚环扩增反应，获得RCP，接着使DP和ALP(碱性磷酸酶)结合于RCP上，在ALP(碱性磷酸酶)的催化作用下，Naphthol(萘酚)的水解产物与FAST RED(固红)发生反应，形成光学显微镜下可见的红色沉淀，从而实现明场下RNA单分子原位检测。
[0008]设计的PLP在5
’
端和3
’
端分别具有一段与靶序列完全互补的序列，如：SEQ ID No 1所示。PLP以拟检测的目标RNA作为夹板，在DNA连接酶的作用下连接形成环状单链DNA分子。
[0009]RCA引物(如：SEQ ID No 2所示)和DP(如：SEQ ID No 3所示)均是针对PLP而设计。
[0010]在本专利技术的一个优选实施方案中，所用的DP为生物素(Biotin)修饰，如：Biotin修饰于核酸序列的5
’
端，并且带有linker序列。
[0011]在本专利技术的一个优选实施方案中，所用的ALP(碱性磷酸酶)系链霉亲和素(SA)修饰，即SA
‑
ALP。
[0012]在本专利技术的一个优选实施方案中，先使DP在RCP上聚集，再使SA
‑
ALP与Biotin
‑
DP连接后被固定在RCP上。
[0013]另一种基于碱性磷酸酶的光学显微镜下实现RNA原位检测的方法，包括以下步骤：
[0014]1)将设计的PLP导入包含拟检测目标RNA的细胞中，使PLP与靶序列杂交，
[0015]2)通过DNA连接酶将PLP的5
’
端和3
’
端连接形成环状单链DNA分子；
[0016]3)将得到的环状单链DNA分子作为模板，加入RCA引物和DNA聚合酶进行RCA反应，获得RCP，每个RCP上都有多个检测探针识别的位点；
[0017]4)将Biotin
‑
DP导入经步骤2)处理的细胞中，使DP在RCP上聚集，然后导入SA
‑
ALP，与Biotin
‑
DP连接后被固定在RCP上；
[0018]5)向经过步骤3)处理后的样品中加入FAST RED(固红)/Naphthol(萘酚)显色底物，在ALP(碱性磷酸酶)的催化作用下，Naphthol(萘酚)被水解产生强反应性的产物，该产物会和FAST RED发生反应，形成光学显微镜下可见的红色沉淀，从而实现明场下RNA单分子原位检测。
[0019]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述目标RNA系在细胞内部表达的RNA，包括细胞自身具有表明其物种特性的基因，也包括通过人为转染或转导的外源性基因，还包括自然发生而转染或转导的外源性基因。
[0020]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述DNA连接酶为Splint R连接酶。
[0021]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述细胞为经分离获得的游离细胞或尚作为组织一部分的细胞。
[0022]另一种基于碱性磷酸酶的光学显微镜下实现RNA原位检测的方法，用于HER2基因的表达水平进行原位检测，包括以下步骤：
[0023]1)将对HER2 mRNA设计的SEQ ID No 1所示的PLP导入拟检测HER2基因靶序列的细胞中，使PLP与靶序列杂交，通过DNA连接酶将PLP的5
’
端和3
’
端连接形成环状单链DNA分子；
[0024]2)将得到的环状单链DNA分子作为模板，加入SEQ ID No 2所示的RCA引物和DNA聚合酶进行RCA反应，获得RCP，每个RCP上都有多个检测探针识别的位点；
[0025]3)将Biotin
‑
DP导入经步骤2)处理的细胞中，使SEQ ID No 3所示的DP在RCP上聚集，然后导入SA
‑
ALP，与Biotin
‑
DP共价连接后被固定在RCP上；
[0026]4)向经过步骤3)处理后的样品中加入FAST RED(固红)/Naphthol(萘酚)溶液，在ALP(碱性磷酸酶)的催化作用下，Nap本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于碱性磷酸酶的单分子RNA显色原位检测，其特征在于包括：1)将锁式探针PLP导入包含拟检测目标RNA的细胞中，与靶序列杂交；2)通过DNA连接酶使所述所示探针形成环状单链DNA分子；3)对所述环状单链DNA分子进行滚环扩增反应，获得滚环扩增产物RCP；4)使检测探针DP和碱性磷酸酶ALP结合于RCP上；5)加入FAST RED(固红)/Naphthol(萘酚)显色底物，在ALP(碱性磷酸酶)的催化作用下，Naphthol(萘酚)的水解产物与FAST RED(固红)发生反应，形成光学显微镜下可见的红色沉淀。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的锁式探针在5
’
端和3
’
端分别具有一段与靶序列完全互补的序列，其以拟检测目标RNA作为夹板，在DNA连接酶的作用下连接形成环状单链DNA分子。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的DNA连接酶为Splint R连接酶。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的ALP为链霉亲和素修饰。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的DP为生物素修饰。6.根据权利要求1所述的方法在HER2基因的表达水平进行原位检测中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的DP的核酸序列如SEQ ID No 3所示。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于SEQ ID No 1所示的PLP以拟检测的目标RNA作为夹板，在DNA连接酶的作用下连接形成环状单链DNA分子，再以SEQ ID No 2所示引物获得所述的滚环扩增产物。9.一种基于碱性磷酸酶的光学显微镜下实现RNA原位检测的方法，用于HER2基因的表达水平进行原位检测，包括以下步骤：1)将对HER2 mRNA设计的SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，黄若兰，王琨，路锟，缪志刚，王春明，顾志鹏，
申请(专利权)人：苏州德运康瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：