一种快速荧光原位杂交体系及杂交方法技术

本发明专利技术提出了一种快速荧光原位杂交体系和杂交方法，其中杂交体系包括GAPDH探针、CAS9蛋白和杂交缓冲液，所述探针5

【技术实现步骤摘要】
一种快速荧光原位杂交体系及杂交方法


[0001]本专利技术涉及荧光原位杂交
，尤其涉及一种快速荧光原位杂交体系及杂交方法。

技术介绍

[0002]荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
[0003]传统的荧光原位杂交的杂交体系包括探针和杂交液，需要在45
‑
68℃条件下杂交16
‑
24h，耗时长，检测效率低。CN108690878A公开了缩短杂交时间的探针，探针复杂，且只能用于肺癌ALK基因重排快速检测，不能用于其他基因检测，通用性差。因此，需要设计一种即可以缩短杂交时间，又可以通用的杂交体系。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提出了一种即可以缩短杂交时间，又可以通用的荧光原位杂交体系和杂交方法。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种快速荧光原位杂交体系，所述杂交体系包括GAPDH探针、CAS9蛋白和杂交缓冲液，所述探针5
’
端为固定区域，核苷酸序列为TAATACGACTCACTATA，3
’
端为蛋白结合区域，核苷酸序列为GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCT AGTCCG TTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT。
[0006]在以上技术方案的基础上，优选的，所述CAS9蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0007]在以上技术方案的基础上，优选的，所述GAPDH探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2
‑
6所示。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，将1
‑
2μg线性化的核酸模板、1
‑
2μL Dig标记或荧光标记的NTP
‑
MIX、4
‑
5μL 5
×
NEB转录缓冲液、1
‑
2μL RNAse抑制剂、1
‑
2μLRNA聚合酶和7
‑
12μL去离子水混合，在35
‑
37℃条件下孵育1
‑
2h，结束后加入1
‑
2μg DNAsel处理10
‑
30min，回收纯化得到GAPDH探针。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，将CAS9基因转接至pET
‑
28a载体，获得pET
‑
28a
‑
CAS9载体，将pET
‑
28a
‑
CAS9载体转化至BL21感受态细胞，培养至菌液OD580为0.4
‑
0.6时，加入IPTG诱导表达，纯化后得到CAS9蛋白。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，所述GAPDH探针浓度为1
‑
10pmoL，CAS9蛋白浓度为1
‑
10μg/mL。
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，所述杂交缓冲液包括Hepes、KCL、MgCL2、
glycerol、BSA和Tween20。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述杂交缓冲液包括20
‑
200mmol/L的Hepes、50
‑
100mmol/L的KCL、5
‑
50mmol/L的MgCL2、1
‑
20％的glycerol、1％
‑
5％的BSA和0.1％
‑
1％的Tween20。
[0013]另一方面，本专利技术提供了一种快速荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
[0014]S1，将上述的GAPDH探针和CAS9蛋白添加至载玻片中样本需杂交区域；
[0015]S2，将加样后的载玻片置于20
‑
30℃条件下孵育15
‑
30min，
[0016]S3，孵育结束后，采用上述的杂交缓冲液洗涤载玻片15min后烘干，镜检。
[0017]本专利技术的荧光原位杂交体系和杂交方法相对于现有技术具有以下有益效果：本专利技术杂交体系中探针和CAS9蛋白连用，可以进行室温实验，而且缩短了杂交时间，由原来的16
‑
24h缩短至15
‑
30min。本专利技术的杂交方法对样本没有严苛的要求，细胞或组织均可以，可以用于固定后的样本，也可以用于非固定的样本；可以用于变性的样本，也可以用于非变性的样本。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1为本专利技术的实施例的镜检图；
[0020]图2为对比例一的镜检图；
[0021]图3为对比例二的镜检图。
具体实施方式
[0022]下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]本申请提出了一种快速荧光原位杂交体系和荧光原位杂交方法，其中杂交体系包括GAPDH探针、CAS9蛋白和杂交缓冲液，GAPDH探针包括5个探针，分别为：
[0024]探针1的核苷酸序列为：5
’‑
TAATACGACTCACTATATTCCATGGGTGGAGT CGTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTAT CAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT
‑3’
，如SEQ ID NO:2所示；
[0025]探针2的核苷酸序列为：5
’‑
TAATACGACTCACTATAAAGACCGTTGATGG GCCCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTA TCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT
‑3’
，如SEQ ID NO:3所示；
[0026]探针3的核苷酸序列为：5
’‑
TAATACGACTCACTATAAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速荧光原位杂交体系，其特征在于：所述杂交体系包括GAPDH探针、CAS9蛋白和杂交缓冲液，所述探针5
’
端为固定区域，核苷酸序列为TAA TACGACTCACTATA，3
’
端为蛋白结合区域，核苷酸序列为GTTTTAGAGCTAGA AATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCAC CGAGTCGGTGCT。2.如权利要求1所述的一种快速荧光原位杂交体系，其特征在于：所述CAS9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.如权利要求1所述的一种快速荧光原位杂交体系，其特征在于：所述GAPDH探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2
‑
6所示。4.如权利要求1所述的一种快速荧光原位杂交体系，其特征在于：所述GAPDH探针的制备方法如下：将1
‑
2μg线性化的核酸模板、1
‑
2μL Dig标记或荧光标记的NTP
‑
MIX、4
‑
5μL 5
×
NEB转录缓冲液、1
‑
2μL RNAse抑制剂、1
‑
2μLRNA聚合酶和7
‑
12μL去离子水混合，在35
‑
37℃条件下孵育1
‑
2h，结束后加入1
‑
2μg DNAsel处理10
‑
30min，回收纯化得到GAPDH探针。5.如权利要求1所述的一种快速荧光原位杂交体系，其特征在于：所述CAS9蛋白的制备方法如下：将CAS9基因转接至pET
‑
28a载体，获得pET

【专利技术属性】
技术研发人员：黄崴，石榴，徐艳华，黄宪，马泽为，
申请(专利权)人：武汉合研生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：