一种用于亚洲棉根尖基因定位研究的RNA原位杂交方法技术

本发明专利技术涉及一种用于亚洲棉根尖基因定位研究的RNA原位杂交方法。首先，根据亚洲棉幼根的稚嫩特性，改进了植物组织培养、取材、固定与脱水等方法，更加完善的保证了组织目标部位的结构完整性；其次，为进一步探索并优化一种适合亚洲棉根尖基因定位的RNA原位杂交方法，对切片的制备、切片预处理、预杂交、杂交以及杂交后处理等方面都进行了改进，从而可以保证亚洲棉根尖特异基因定位的准确性、特异性以及高效性，更加适合应用到亚洲棉根尖单细胞转录组测序的标记基因定位中去。本发明专利技术提供的RNA原位杂交方法是首次运用到棉花根尖基因定位的RNA原位杂交方法，具有很大的创新性与适用性。具有很大的创新性与适用性。具有很大的创新性与适用性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于亚洲棉根尖基因定位研究的RNA原位杂交方法


[0001]本专利技术涉及植物分子生物学技术以及植物显微
，具体涉及一种用于亚洲棉根尖基因定位研究的RNA原位杂交方法。

技术介绍

[0002]棉花是一种重要的经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原材料，是人们衣被和日用纺织品的主要原材料。18世纪工业革命以来，飞梭、纺纱机、织布机和轧花机的相继专利技术，推动了棉纺织工业以及棉花生产的发展，使棉花的地位日益重要。近百年来，棉花纤维在纺织原料总消费中所占比例始终名列前茅。亚洲棉(G.arboreum L.)原产于亚洲，由亚洲人最早栽培和传播，又称土棉、紫棉、小棉花等。由于引种亚洲棉的历史比较悠久，种植地区比较广泛，在长期的栽培过程中，产生了许多优良品种和变异品种，从而形成了著名的中棉种系。因此，亚洲棉对棉纤维的发展与改进起着重要的作用。
[0003]随着基因组学研究的不断深入，植物生物学领域出现了大量对基因表达进行定量分析的研究，微阵列和下一代测序方法正被用于研究发育、生理和应激反应过程，解剖表观遗传和小RNA通路，并构建大型基因调控网本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于亚洲棉根尖基因定位研究的RNA原位杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、目标基因的探针制备；S1、含有序列如SEQ ID NO.1所示目标基因的正义探针和反义探针的制备；S2、实验样品的准备：制作亚洲棉根尖的石蜡切片；S3、预杂交：对步骤S2中获得的结构完整的杂交切片进行脱蜡、梯度酒精复水处理、HCl处理、Proteinase K消化、RNA再固定、乙酰化作用以及脱水再处理后，将切片放入染色架上于4℃密封保存；S4、杂交孵育处理：对步骤S3获得的杂交切片样品，首先在50℃保温箱中避光与步骤S1获得的正义探针和反义探针进行第一次杂交孵育处理，然后在室温下进行第二次杂交孵育处理；S5、杂交后处理：将步骤S4中获得的样品依次经过TBS
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BSA、Buffer3处理，然后经过NBT/BCIP显色液显色处理；S6、镜检：将显色的切片样品用蒸馏水漂去parafilm膜，然后在通风橱中吹干，待切片吹干后放在显微镜下检测，观察并拍照；S7、反应终止后处理与保存：对于观察到杂交信号的切片样本，用蒸馏水进行终止反应，梯度乙醇、梯度二甲苯进行处理，然后在通风橱中吹干，每张载玻片加入80μL中性树胶(中性树脂：二甲苯的体积比为1：1)进行封片，37℃烘干，实验结果可长久保存。2.如权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，在步骤S1中，先通过PCR扩增获得序列如SEQ ID NO.1所示目标基因，将目标基因转录连接T7启动子获得正义探针，将目标基因转录连接SP6启动子获得反义探针。3.如权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，在步骤S2中实验样品的准备具体包括如下步骤：S21、实验材料的培养：采用组织培养的方法，选取颗粒饱满的亚洲棉种子放入MS培养基中生长；S22、实验材料的取材与固定：选取生长5天且长势一致的亚洲棉侧根根尖于冰上取1
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2cm长度的根尖片段作为实验样品，放入预冷的固定液；抽真空处理，使固定液快速进入实验样品内部；S23、实验材料的脱水：将实验样品依次经过50％乙醇三次、每次时间30min；70％乙醇、时间为过夜；85％乙醇、时间为1h；95％乙醇、时间为过夜；无水乙醇两次、每次1h，进行脱水处理，其中，整个过程在4℃冰箱中操作，乙醇由DEPC水稀释；S24、实验材料的透明：在室温下进行，将实验样品依次经过乙醇:二甲苯体积比为3:1、1:1、1:3、0:1、0:1的溶液，各1h，进行透明处理；S25、实验材料的浸蜡：将实验样品放入装有50mL二甲苯与1/4体积的碎蜡屑中，放入42℃烘箱中过夜处理；在二甲苯中继续补充碎蜡，使二甲苯溶液逐渐饱和，该过程进行2
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3天；将实验样品转移至溶解好的纯液体石蜡中，在60℃烘箱中浸蜡，连续3天晚上更换新鲜的液体石蜡，达到使石蜡充满植物样品内部的目的；S26、实验材料的包埋：将溶解的纯液体石蜡倒入预热好的包埋模具中，将实验样品取出放入包埋模具中并按切片要求摆好位置，待石蜡表面凝固后，将其迅速放入冷水中，使其
石蜡迅速凝固；S27、实验材料的修蜡：将蜡块从包埋模具中取出，根据石蜡切片的需要将蜡块样品修成横切或者纵切的方向，切片机刀片的切面要成长方形，否则不易切成蜡带；S28、实验材料的杂交切片制备：将蜡块切成厚度为6
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10μm的切片蜡带，在无RNase的载玻片上滴加DEPC水，用刀片将蜡带分成小片段，平铺在载玻片上，使蜡带浮于DEPC水上，将载玻片放于37℃烘片机上不超过5min，防止RNA降解，待蜡带展平后吸走多余的水，最后将载玻片置于切片盒中4℃保存备用。4.如权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，所述MS培养基的配方为MURASHIGE&SKOOG 4.33g/L、葡萄糖15g/L、Phytagel 2.6g/L，培养基的pH为6.1
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6.2，培养条件为28℃恒温，16h光照/8h黑暗；所述固定液为50％FAA，包括：50mL无水乙醇、10mL 37％甲醛溶液、5mL冰乙酸、35mL DEPC水；所述抽真空压强范围为0.04
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0.06MPa，直至所有样品材料下沉到固定液中。5.如权利要求1所述的RNA原位杂交方法，其特征在于，步骤S3中所述预杂交过程为：将载玻片上的切片样品依次经过100％二甲苯10min；100％二甲苯10min进行脱蜡处理；75％二甲苯+25％乙醇2min；25％二甲苯+75％乙醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏涛，刘乾坤，程爽，韦洋洋，刘玉玲，卢全伟，韩江萍，周忠丽，蔡小彦，王玉红，刘方，彭仁海，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：