本发明专利技术属于生物技术领域，涉及抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3及其在检测中的应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体1F3，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、免疫方法等技术实现对该抗体的应用。本发明专利技术的优点在于提供了一种抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的H10亚型禽流感样本进行定性诊断。型禽流感样本进行定性诊断。型禽流感样本进行定性诊断。
【技术实现步骤摘要】
No.2，轻链氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示。
[0008]抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3由杂交瘤细胞产生的；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、稳定传代后获得的杂交瘤细胞系1F3，能稳定分泌抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3。
[0009]本专利技术的第二个目的提供抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：
[0010](1)动物的免疫：选择6
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8周龄BALB/C小鼠，以纯化的H10N3亚型禽流感病毒(A/Duck/Human/S11205/2012) 血凝素蛋白对小鼠进行免疫。
[0011](2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。
[0012](3)细胞融合：采用聚乙二醇介导的细胞融合法。将步骤(1)中挑选出的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集步骤(2)中的SP2/0细胞，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至96孔培养板，适当条件培养。
[0013](4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在次黄嘌呤
‑
磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。
[0014](5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96 孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取上清做酶联免疫吸附检测，筛选和鉴定阳性克隆。选择抗体效价最高的且呈单个克隆细胞生长的培养孔，再次进行有限稀释，连续进行4次以上的有限稀释，并连续传代20代以上，获得稳定高效表达抗H10亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将克隆化后的杂交瘤细胞做抗体鉴定及理化性状分析。
[0015](6)单克隆抗体腹水制备：选择8
‑
10周BALB/C健康小鼠，每只腹部接种含5
×
106个阳性杂交瘤细胞 PBS缓冲液，接种细胞7
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10天后小鼠腹部明显膨大，密切观察小鼠的健康状况腹部征象，待腹水尽可能多，并且小鼠濒临死亡之前，收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化腹水中的单克隆抗体；
[0016](7)单克隆抗体的纯化：使用蛋白G琼脂凝胶亲和纯化法纯化小鼠腹水中单克隆抗体
[0017](8)本专利技术得到一个产生抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体杂交瘤系，即1F3，1F3杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。酶联免疫吸附间接法实验测得1F3培养上清效价为1:64，腹水效价为1:2048。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1。
[0018]本专利技术提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代后获得的小鼠杂交瘤细胞系1F3，能稳定分泌抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3。
[0019]本专利技术的另一个目的是提供该单克隆抗体1F3在含有H10亚型禽流感病毒的体液、尿囊液或其他环境样本中的检测，通过制备胶体金免疫层析试纸条和酶联免疫吸附法实现。
[0020]本专利技术的优点在于提供了一种抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的H10亚型禽流感样本进行定性诊断。
[0021]说明书附图
[0022]图1为单克隆抗体1F3的免疫球蛋白亚型分析。
[0023]图2为免疫荧光技术检测H10亚型禽流感病毒的特异性。
[0024]图3为单克隆抗体1F3的生物序列。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0026]实施例1.抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备方法
[0027](1)小鼠的免疫：首次免疫，将H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白与佐剂1:1体积混合均匀，总体积0.5 毫升。每只BALB/C小鼠0.1毫升(含H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白抗原100微克)，大腿内侧肌肉注射。第21天按同样方式加强免疫一次。第35天采微量尾血进行酶联免疫吸附实验测定，抗体滴度最高达到1:32000, 选择抗体滴度最高的小鼠尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。
[0028](2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养传代：用10％牛血清的DMEM培养基对来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株进行培养传代，在含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。融合前一天通常不传代以保证融合时细胞进入对数生长期。
[0029](3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤
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鸟嘌呤
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磷酸核糖转移酶培养基培养一天。取最后一次加强免疫3天的小鼠取脾，采用压力注水法分离脾脏淋巴细胞，离心洗涤细胞后用DMEM培养液重悬。收集SP2/0细胞，离心，洗涤后用DMEM培养液重悬，进行计数。将3
×
108个免疫小鼠脾淋巴细胞与3
×
107个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合。两种细胞混合，离心弃上清，用手掌轻轻搓动离心管，使细胞块松动，用融合管缓慢加入37℃预温的聚乙二醇，其间轻轻振摇离心管，将细胞吸入融合管，静置90秒后将细胞吹入离心管，然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1毫升DMEM培养基，于第2分钟内加完2毫升DMEM培养基，于第3分钟内加完7毫升DMEM培养基，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的DMEM培养基40毫升。800转每分钟低速离心10 分钟。然后加入含有20％牛血清的次黄嘌呤
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鸟嘌呤
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磷酸核糖转移酶培养基，用玻璃滴管分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺2
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4块板，在含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。
[0030](4)杂交瘤细胞的筛选：96孔培养板5天后半量换液(含次黄嘌呤
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鸟嘌呤
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磷酸核糖转移酶)一次，10 天后改用含次黄嘌呤
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磷酸核糖转移酶培养液。融合后的杂交瘤细胞在含次黄嘌呤
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磷酸核糖转移酶的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时(在10倍物镜下观察，细胞克隆大小以占满一个视野为宜)，吸取细胞培养上清液进行酶联免疫吸附实验，筛选阳性克隆。采用酶联免疫吸附实验间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：
①
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，抗体亚型为IgG1，κ型，能与H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。2.根据权利要求1所述的抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，其特征在于：抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。3.根据权利要求1所述的抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，其特征在于：由杂交瘤细胞产生的；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、稳定传代后获得的杂交瘤细胞系1F3，能稳定分泌抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3。4.权利要求1所述的抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，其特征在于：该单克隆抗体通过的以下步骤获得：(1)小鼠免疫：选择6
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8周龄的BALB/C小鼠，通过纯化的H10亚型禽流感病毒的血凝素蛋白对小鼠进行免疫；每只小鼠以100微克的H10亚型血凝素蛋白1:1混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后按同样方式再免疫一次，共2次；第35天采微量小鼠尾血，测定小鼠抗体效价，选取免疫效价最高的小鼠，尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：在准备融合前的两周开始复苏骨髓瘤细胞SP2/0，培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；(3)细胞融合：采用聚乙二醇介导的细胞融合法；将步骤(1)中挑选出的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞；将脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞混合离心，然后通过聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴海波，杨帆，肖一鑫，吴南屏，姚航平，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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